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1、关于蛋白质的表征第一页，讲稿共三十四页哦第一节第一节 蛋白质结构的基本概念蛋白质结构的基本概念 蛋白质是一类重要的生物高分子，英文为蛋白质是一类重要的生物高分子，英文为蛋白质是一类重要的生物高分子，英文为蛋白质是一类重要的生物高分子，英文为“ProteinProtein，该词从希腊文，该词从希腊文，该词从希腊文，该词从希腊文转化而来，意思是转化而来，意思是转化而来，意思是转化而来，意思是“最原始的最原始的最原始的最原始的”，可见当时人们对蛋白质的认识已有相当，可见当时人们对蛋白质的认识已有相当，可见当时人们对蛋白质的认识已有相当，可见当时人们对蛋白质的认识已有相当的基础。的基础。的基础。的基础
2、。蛋白质有成千上万种，不同的蛋白质具有不同的生物功能。蛋白质是蛋白质有成千上万种，不同的蛋白质具有不同的生物功能。蛋白质是蛋白质有成千上万种，不同的蛋白质具有不同的生物功能。蛋白质是蛋白质有成千上万种，不同的蛋白质具有不同的生物功能。蛋白质是2020种种种种氨基酸通过酰胺键氨基酸通过酰胺键氨基酸通过酰胺键氨基酸通过酰胺键(肽键肽键肽键肽键)联成的长链分子，这种长链即所谓的联成的长链分子，这种长链即所谓的联成的长链分子，这种长链即所谓的联成的长链分子，这种长链即所谓的肽链。许多蛋白质还包含有非肽链结构的其他组成成分，这种成分称为肽链。许多蛋白质还包含有非肽链结构的其他组成成分，这种成分称为肽链。
3、许多蛋白质还包含有非肽链结构的其他组成成分，这种成分称为肽链。许多蛋白质还包含有非肽链结构的其他组成成分，这种成分称为配基或辅基。配基或辅基。配基或辅基。配基或辅基。作为蛋白质组成成分的氨基酸一共有作为蛋白质组成成分的氨基酸一共有作为蛋白质组成成分的氨基酸一共有作为蛋白质组成成分的氨基酸一共有2020种，它们的名称和结构列在表种，它们的名称和结构列在表种，它们的名称和结构列在表种，它们的名称和结构列在表1.11.1中。为了表达蛋白质和肽结构的需要，每个氨基酸都有相应的符号表中。为了表达蛋白质和肽结构的需要，每个氨基酸都有相应的符号表中。为了表达蛋白质和肽结构的需要，每个氨基酸都有相应的符号表中
4、。为了表达蛋白质和肽结构的需要，每个氨基酸都有相应的符号表示，常用符号通常由氨基酸英文名的三个字母组成。一个蛋白质由上百示，常用符号通常由氨基酸英文名的三个字母组成。一个蛋白质由上百示，常用符号通常由氨基酸英文名的三个字母组成。一个蛋白质由上百示，常用符号通常由氨基酸英文名的三个字母组成。一个蛋白质由上百个甚至上千个氨基酸组成，为了表达的方便，又设计出单字符号。个甚至上千个氨基酸组成，为了表达的方便，又设计出单字符号。个甚至上千个氨基酸组成，为了表达的方便，又设计出单字符号。个甚至上千个氨基酸组成，为了表达的方便，又设计出单字符号。第二页，讲稿共三十四页哦 除了列出的除了列出的20种基本氨基酸
5、外，实际上种基本氨基酸外，实际上还有几百种不常见的氨基酸参与某些蛋白质还有几百种不常见的氨基酸参与某些蛋白质的组分，可称为稀有氨基酸；另一些氨基酸的组分，可称为稀有氨基酸；另一些氨基酸出现频率要高些，如羟脯氨酸、甲基组氨出现频率要高些，如羟脯氨酸、甲基组氨酸和甲基赖氨酸、丁酸和甲基赖氨酸、丁羧基谷氨酸等，但它羧基谷氨酸等，但它们是在蛋白质生物合成后转变而来的，因此们是在蛋白质生物合成后转变而来的，因此不计入基本氨基酸之列。不计入基本氨基酸之列。第三页，讲稿共三十四页哦 这是一个链状的结构，经水解后，将肽键断裂，转变成一系列的氨基酸。链中相当于氨基酸的单元结构称为残基。而上述链称为肽链。肽链的氨
6、基一端称为N端或氨基端，羧基一端称为C端或羧基端。习惯上将N端列在左边，C端列在右边。第四页，讲稿共三十四页哦 从氨基酸的结构看，半胱氨酸的侧链上有巯基从氨基酸的结构看，半胱氨酸的侧链上有巯基(一一SH)SH)。巯。巯基的稳定性较差，在碱性基的稳定性较差，在碱性pHpH下易氧化成二硫键。如果一条肽下易氧化成二硫键。如果一条肽链上的两个半胱氨酸的巯基形成二硫键，肽链形成链内二硫链上的两个半胱氨酸的巯基形成二硫键，肽链形成链内二硫键。假如两条肽链间形成二硫键，就出现由两条肽链组成的键。假如两条肽链间形成二硫键，就出现由两条肽链组成的蛋白质蛋白质(如胰岛素如胰岛素)。蛋白质分子有两对以上的二硫键，或
7、者。蛋白质分子有两对以上的二硫键，或者是蛋白质分子有一对二硫键和一个半胱氨酸，二硫键可能有是蛋白质分子有一对二硫键和一个半胱氨酸，二硫键可能有不同的连接方式，于是出现了异构体。异构体的数目因半胱不同的连接方式，于是出现了异构体。异构体的数目因半胱氨酸含量不同而异，但是在天然的蛋白质分子中没有这种异氨酸含量不同而异，但是在天然的蛋白质分子中没有这种异构体，只有一种连接方式。而在重组蛋白质的复性中，可能构体，只有一种连接方式。而在重组蛋白质的复性中，可能出现二硫键的错配对。出现二硫键的错配对。第五页，讲稿共三十四页哦 一级结构是指肽链中的氨基酸排列序列，二硫键的定位也是一级结构一级结构是指肽链中的
8、氨基酸排列序列，二硫键的定位也是一级结构一级结构是指肽链中的氨基酸排列序列，二硫键的定位也是一级结构一级结构是指肽链中的氨基酸排列序列，二硫键的定位也是一级结构的重要内容。的重要内容。的重要内容。的重要内容。蛋白质的二级结构也可称为构象单元，因为它们是蛋白质复杂的空间蛋白质的二级结构也可称为构象单元，因为它们是蛋白质复杂的空间蛋白质的二级结构也可称为构象单元，因为它们是蛋白质复杂的空间蛋白质的二级结构也可称为构象单元，因为它们是蛋白质复杂的空间构象的基础。一些构象单元的结构不是不可改变的，构象的基础。一些构象单元的结构不是不可改变的，构象的基础。一些构象单元的结构不是不可改变的，构象的基础。一
9、些构象单元的结构不是不可改变的，pHpH、温度、溶剂极、温度、溶剂极、温度、溶剂极、温度、溶剂极性等环境因素可以影响单元的变化。性等环境因素可以影响单元的变化。性等环境因素可以影响单元的变化。性等环境因素可以影响单元的变化。具有二级结构的肽链在空间走向，形成具有空间三级结构的蛋白质，具有二级结构的肽链在空间走向，形成具有空间三级结构的蛋白质，具有二级结构的肽链在空间走向，形成具有空间三级结构的蛋白质，具有二级结构的肽链在空间走向，形成具有空间三级结构的蛋白质，如所谓球蛋白类，它们几乎都有生物功能和活性，其中有些还能进一步如所谓球蛋白类，它们几乎都有生物功能和活性，其中有些还能进一步如所谓球蛋白
10、类，它们几乎都有生物功能和活性，其中有些还能进一步如所谓球蛋白类，它们几乎都有生物功能和活性，其中有些还能进一步相互作用，形成更高层次的结构。蛋白质之所以有功能，是因为分子表相互作用，形成更高层次的结构。蛋白质之所以有功能，是因为分子表相互作用，形成更高层次的结构。蛋白质之所以有功能，是因为分子表相互作用，形成更高层次的结构。蛋白质之所以有功能，是因为分子表面有可以进一步作用的基团，不同的蛋白质由于分子表面结构不同，可面有可以进一步作用的基团，不同的蛋白质由于分子表面结构不同，可面有可以进一步作用的基团，不同的蛋白质由于分子表面结构不同，可面有可以进一步作用的基团，不同的蛋白质由于分子表面结构
11、不同，可作用的基团分布和组合也不同，这种特定的结构就是各种蛋白质具有不作用的基团分布和组合也不同，这种特定的结构就是各种蛋白质具有不作用的基团分布和组合也不同，这种特定的结构就是各种蛋白质具有不作用的基团分布和组合也不同，这种特定的结构就是各种蛋白质具有不同的功能和活性的分子基础。同的功能和活性的分子基础。同的功能和活性的分子基础。同的功能和活性的分子基础。四级结构可以认为是一些特定三级结构的折叠肽链通过非共价键而形四级结构可以认为是一些特定三级结构的折叠肽链通过非共价键而形四级结构可以认为是一些特定三级结构的折叠肽链通过非共价键而形四级结构可以认为是一些特定三级结构的折叠肽链通过非共价键而形
12、成的大分子体系，也可称为亚基的装配成的大分子体系，也可称为亚基的装配成的大分子体系，也可称为亚基的装配成的大分子体系，也可称为亚基的装配(assembly)(assembly)。装配是一个非常复。装配是一个非常复。装配是一个非常复。装配是一个非常复杂的过程，它能使各亚基间相互调节，使蛋白质分子的功能更完善。杂的过程，它能使各亚基间相互调节，使蛋白质分子的功能更完善。杂的过程，它能使各亚基间相互调节，使蛋白质分子的功能更完善。杂的过程，它能使各亚基间相互调节，使蛋白质分子的功能更完善。第六页，讲稿共三十四页哦 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质的来源是多样蛋白质的分离纯化是研究蛋白
13、质的基础和起点。蛋白质的来源是多样蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质的来源是多样蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质的来源是多样的，主要来自动物、植物的各种组织和微生物，取材要采用含量丰富的的，主要来自动物、植物的各种组织和微生物，取材要采用含量丰富的的，主要来自动物、植物的各种组织和微生物，取材要采用含量丰富的的，主要来自动物、植物的各种组织和微生物，取材要采用含量丰富的器官。器官。器官。器官。抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎，破坏细胞，以便于抽提出蛋白抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎，破坏细胞，以便于抽提出蛋白抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎，破坏细胞，以便于抽提出蛋白
14、抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎，破坏细胞，以便于抽提出蛋白质；抽提液的选择也因蛋白质而异。一般用低浓度的缓冲液，有时在从质；抽提液的选择也因蛋白质而异。一般用低浓度的缓冲液，有时在从质；抽提液的选择也因蛋白质而异。一般用低浓度的缓冲液，有时在从质；抽提液的选择也因蛋白质而异。一般用低浓度的缓冲液，有时在从肌肉抽提时也用稀碱，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的肌肉抽提时也用稀碱，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的肌肉抽提时也用稀碱，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的肌肉抽提时也用稀碱，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的pHpH却是中性却是中性却是中性却是中性的。在提取膜蛋白或包含体内的蛋白质时，还加入的。在提取
15、膜蛋白或包含体内的蛋白质时，还加入的。在提取膜蛋白或包含体内的蛋白质时，还加入的。在提取膜蛋白或包含体内的蛋白质时，还加入(非离子型非离子型非离子型非离子型)表面活性表面活性表面活性表面活性剂或变性剂以增加溶解度。各种细胞中普遍存在各种蛋白水解酶，会导剂或变性剂以增加溶解度。各种细胞中普遍存在各种蛋白水解酶，会导剂或变性剂以增加溶解度。各种细胞中普遍存在各种蛋白水解酶，会导剂或变性剂以增加溶解度。各种细胞中普遍存在各种蛋白水解酶，会导致蛋白质的降解，低温操作和加一些相应蛋白酶抑制剂致蛋白质的降解，低温操作和加一些相应蛋白酶抑制剂致蛋白质的降解，低温操作和加一些相应蛋白酶抑制剂致蛋白质的降解，低
16、温操作和加一些相应蛋白酶抑制剂(如如如如DFPDFP、PCMBPCMB、PMSFPMSF等等等等)、螯合剂、螯合剂、螯合剂、螯合剂(EDTA(EDTA等等等等)是有益的。是有益的。是有益的。是有益的。将蛋白质抽提出来后，就要进一步纯化。将蛋白质抽提出来后，就要进一步纯化。将蛋白质抽提出来后，就要进一步纯化。将蛋白质抽提出来后，就要进一步纯化。纯化不外乎两方面：一是将纯化不外乎两方面：一是将纯化不外乎两方面：一是将纯化不外乎两方面：一是将大体积变成小体积；二是把多组分蛋白质只留下单一种的蛋白质。大体积变成小体积；二是把多组分蛋白质只留下单一种的蛋白质。大体积变成小体积；二是把多组分蛋白质只留下单
17、一种的蛋白质。大体积变成小体积；二是把多组分蛋白质只留下单一种的蛋白质。前者前者前者前者有吸附法、超滤法、冻干等。后者有根据蛋白质的分子形状和分子质量有吸附法、超滤法、冻干等。后者有根据蛋白质的分子形状和分子质量有吸附法、超滤法、冻干等。后者有根据蛋白质的分子形状和分子质量有吸附法、超滤法、冻干等。后者有根据蛋白质的分子形状和分子质量大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等，常用有各种盐大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等，常用有各种盐大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等，常用有各种盐大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等，常用有各种盐析法、超离心沉降
18、、结晶、电泳、凝胶过滤，离子交换色谱、亲和色谱析法、超离心沉降、结晶、电泳、凝胶过滤，离子交换色谱、亲和色谱析法、超离心沉降、结晶、电泳、凝胶过滤，离子交换色谱、亲和色谱析法、超离心沉降、结晶、电泳、凝胶过滤，离子交换色谱、亲和色谱等。近年来发展的等。近年来发展的等。近年来发展的等。近年来发展的FPLCFPLC和和和和HPLCHPLC大大促进了许多蛋白质在毫克级的纯大大促进了许多蛋白质在毫克级的纯大大促进了许多蛋白质在毫克级的纯大大促进了许多蛋白质在毫克级的纯化，其量足够用于蛋白质的化学研究。化，其量足够用于蛋白质的化学研究。化，其量足够用于蛋白质的化学研究。化，其量足够用于蛋白质的化学研究。
19、第七页，讲稿共三十四页哦第二节第二节 蛋白质的纯度蛋白质的纯度 蛋白质的纯度是一个重要的指标，尤其在重组蛋白的质量控制中。但它也是蛋白质的纯度是一个重要的指标，尤其在重组蛋白的质量控制中。但它也是蛋白质的纯度是一个重要的指标，尤其在重组蛋白的质量控制中。但它也是蛋白质的纯度是一个重要的指标，尤其在重组蛋白的质量控制中。但它也是一个相对的指标，而纯度要求一个相对的指标，而纯度要求一个相对的指标，而纯度要求一个相对的指标，而纯度要求9595、9999或或或或99.999.9需根据实际要求而制定。需根据实际要求而制定。需根据实际要求而制定。需根据实际要求而制定。蛋白质的纯度一般指是否含有其他杂蛋白，
20、而不包括盐、缓冲液离子、十二蛋白质的纯度一般指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、十二蛋白质的纯度一般指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、十二蛋白质的纯度一般指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、十二烷基硫酸钠烷基硫酸钠烷基硫酸钠烷基硫酸钠(SDS)(SDS)等小分子在内。一些蛋白质在硫酸铵糊中相当稳定，一些酶在等小分子在内。一些蛋白质在硫酸铵糊中相当稳定，一些酶在等小分子在内。一些蛋白质在硫酸铵糊中相当稳定，一些酶在等小分子在内。一些蛋白质在硫酸铵糊中相当稳定，一些酶在甘油中保存则很稳定。甘油中保存则很稳定。甘油中保存则很稳定。甘油中保存则很稳定。蛋白质纯度如用百分
21、数表示，有时还和检测方法、定量方法、所选用仪器的蛋白质纯度如用百分数表示，有时还和检测方法、定量方法、所选用仪器的蛋白质纯度如用百分数表示，有时还和检测方法、定量方法、所选用仪器的蛋白质纯度如用百分数表示，有时还和检测方法、定量方法、所选用仪器的参数有关。例如在参数有关。例如在参数有关。例如在参数有关。例如在HPLCHPLC分析蛋白质纯度时，一般要求以分析蛋白质纯度时，一般要求以分析蛋白质纯度时，一般要求以分析蛋白质纯度时，一般要求以280nm280nm检测，这是蛋白检测，这是蛋白检测，这是蛋白检测，这是蛋白质的吸收高峰，而很可能不是非蛋白质杂质的紫外吸收峰，甚至小分子物质在质的吸收高峰，而很
22、可能不是非蛋白质杂质的紫外吸收峰，甚至小分子物质在质的吸收高峰，而很可能不是非蛋白质杂质的紫外吸收峰，甚至小分子物质在质的吸收高峰，而很可能不是非蛋白质杂质的紫外吸收峰，甚至小分子物质在280nm280nm处没有吸收，因此都以处没有吸收，因此都以处没有吸收，因此都以处没有吸收，因此都以280nm280nm的光吸收来定量处理，检测不到非蛋白质的光吸收来定量处理，检测不到非蛋白质的光吸收来定量处理，检测不到非蛋白质的光吸收来定量处理，检测不到非蛋白质杂质和小分子物质的存在，表明所得的蛋白质纯度会偏高。杂质和小分子物质的存在，表明所得的蛋白质纯度会偏高。杂质和小分子物质的存在，表明所得的蛋白质纯度会
23、偏高。杂质和小分子物质的存在，表明所得的蛋白质纯度会偏高。在色谱中普遍采用积分面积的方法，这也不是很妥当的。而且在用计算机或在色谱中普遍采用积分面积的方法，这也不是很妥当的。而且在用计算机或在色谱中普遍采用积分面积的方法，这也不是很妥当的。而且在用计算机或在色谱中普遍采用积分面积的方法，这也不是很妥当的。而且在用计算机或积分仪在线检出时，仪器的参数设置与所得的报告很有关系，设置不妥往往导积分仪在线检出时，仪器的参数设置与所得的报告很有关系，设置不妥往往导积分仪在线检出时，仪器的参数设置与所得的报告很有关系，设置不妥往往导积分仪在线检出时，仪器的参数设置与所得的报告很有关系，设置不妥往往导致结果
24、不够准确。致结果不够准确。致结果不够准确。致结果不够准确。第八页，讲稿共三十四页哦 目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有：目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有：目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有：目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳电泳电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)；毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳(CE)(CE)；等电聚焦等电聚焦等电聚焦等电聚焦(IEF)(IEF)；高效液相色谱高效液相色谱高
25、效液相色谱高效液相色谱(HPLC)(HPLC)，包括凝胶过滤、各种反相色谱、，包括凝胶过滤、各种反相色谱、，包括凝胶过滤、各种反相色谱、，包括凝胶过滤、各种反相色谱、离子色谱、疏水色谱等；离子色谱、疏水色谱等；离子色谱、疏水色谱等；离子色谱、疏水色谱等；质谱质谱质谱质谱(MS)(MS)。一些新的有效方法也在引入分析蛋白质的纯度，如质谱一些新的有效方法也在引入分析蛋白质的纯度，如质谱一些新的有效方法也在引入分析蛋白质的纯度，如质谱一些新的有效方法也在引入分析蛋白质的纯度，如质谱等。由于它测定分子质量的精确度可达万分之一，因此丢失等。由于它测定分子质量的精确度可达万分之一，因此丢失等。由于它测定分
26、子质量的精确度可达万分之一，因此丢失等。由于它测定分子质量的精确度可达万分之一，因此丢失一个氨基酸残基一个氨基酸残基一个氨基酸残基一个氨基酸残基(平均分子质量约平均分子质量约平均分子质量约平均分子质量约110Da)110Da)就可以检出；如有就可以检出；如有就可以检出；如有就可以检出；如有氨基酸的取代形成突变株氨基酸的取代形成突变株氨基酸的取代形成突变株氨基酸的取代形成突变株(可能分子质量有几十道尔顿的差可能分子质量有几十道尔顿的差可能分子质量有几十道尔顿的差可能分子质量有几十道尔顿的差异异异异)，也非常容易被发现。，也非常容易被发现。，也非常容易被发现。，也非常容易被发现。第九页，讲稿共三十
27、四页哦 按照严格的要求，用电泳法证明蛋白质的纯度，按照严格的要求，用电泳法证明蛋白质的纯度，在一种在一种pH下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充分的。应该取两种分的。应该取两种分的。应该取两种分的。应该取两种pHpH缓冲液，它们分布在蛋白质等缓冲液，它们分布在蛋白质等缓冲液，它们分布在蛋白质等缓冲液，它们分布在蛋白质等电点的两侧，在这两种电点的两侧，在这两种电点的两侧，在这两种电点的两侧，在这两种pHpH下电泳都证明此蛋白质是下电泳都证明此蛋白质是纯的，这样才可靠。纯的，这样才可靠。纯的
28、，这样才可靠。纯的，这样才可靠。应该指出，只用一种方法鉴定蛋白质纯度是不够应该指出，只用一种方法鉴定蛋白质纯度是不够应该指出，只用一种方法鉴定蛋白质纯度是不够应该指出，只用一种方法鉴定蛋白质纯度是不够的，至少应该用两种以上的方法，而且是两种不同的，至少应该用两种以上的方法，而且是两种不同的，至少应该用两种以上的方法，而且是两种不同的，至少应该用两种以上的方法，而且是两种不同的分离机理的方法来判断蛋白质纯度才比较可靠。的分离机理的方法来判断蛋白质纯度才比较可靠。的分离机理的方法来判断蛋白质纯度才比较可靠。的分离机理的方法来判断蛋白质纯度才比较可靠。因为常常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在因为
29、常常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在因为常常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在因为常常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在离子色谱中却分辨为两个组分，反之亦然。离子色谱中却分辨为两个组分，反之亦然。离子色谱中却分辨为两个组分，反之亦然。离子色谱中却分辨为两个组分，反之亦然。又如，一种样品用凝胶过滤法和又如，一种样品用凝胶过滤法和又如，一种样品用凝胶过滤法和又如，一种样品用凝胶过滤法和SDSPAGESDSPAGE电电泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两种方法的泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两种方法的泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两种方法的泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两种方法的
30、机制是相同的。机制是相同的。机制是相同的。机制是相同的。第十页，讲稿共三十四页哦第三节第三节 蛋白质的定量蛋白质的定量 测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步，而对蛋白质定量方法测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步，而对蛋白质定量方法测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步，而对蛋白质定量方法测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步，而对蛋白质定量方法的原理、适用范围、灵敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。的原理、适用范围、灵敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。的原理、适用范围、灵敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。的原理、适用范围、灵敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。溶液中蛋白质的浓
31、度测定方法很多，最早的经典方法是克氏定氮法，溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是克氏定氮法，溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是克氏定氮法，溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是克氏定氮法，因为每一种蛋白质都有其恒定的含氮量因为每一种蛋白质都有其恒定的含氮量因为每一种蛋白质都有其恒定的含氮量因为每一种蛋白质都有其恒定的含氮量(14(141616)。其方法是将一定量的蛋白质用浓硫酸消化分解，使其中的氮变成铵其方法是将一定量的蛋白质用浓硫酸消化分解，使其中的氮变成铵其方法是将一定量的蛋白质用浓硫酸消化分解，使其中的氮变成铵其方法是将一定量的蛋白质用浓硫酸消化分解，
32、使其中的氮变成铵盐，再与浓盐，再与浓盐，再与浓盐，再与浓NaOHNaOH作用，使氨气放出而被吸收于标准酸液中，用反滴定作用，使氨气放出而被吸收于标准酸液中，用反滴定作用，使氨气放出而被吸收于标准酸液中，用反滴定作用，使氨气放出而被吸收于标准酸液中，用反滴定法滴定残余的酸，或用硼酸吸收后，再用标准酸直接滴定，求得该蛋白质法滴定残余的酸，或用硼酸吸收后，再用标准酸直接滴定，求得该蛋白质法滴定残余的酸，或用硼酸吸收后，再用标准酸直接滴定，求得该蛋白质法滴定残余的酸，或用硼酸吸收后，再用标准酸直接滴定，求得该蛋白质样品中的含氮量。样品中的含氮量。样品中的含氮量。样品中的含氮量。此法虽有普遍性，但操作繁
33、琐，目前应用较少。稍后应用较广泛的方法此法虽有普遍性，但操作繁琐，目前应用较少。稍后应用较广泛的方法此法虽有普遍性，但操作繁琐，目前应用较少。稍后应用较广泛的方法此法虽有普遍性，但操作繁琐，目前应用较少。稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林是双缩脲法、福林是双缩脲法、福林是双缩脲法、福林酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。法。法。法。选择哪一种方法，一般考虑的选择哪一种方法，一般考虑的选择哪一种方法，一般考虑的选择哪一种方法，一般考虑的原则是准确、操作
34、方便、影响因素少原则是准确、操作方便、影响因素少原则是准确、操作方便、影响因素少原则是准确、操作方便、影响因素少第十一页，讲稿共三十四页哦一、光吸收法一、光吸收法一、光吸收法一、光吸收法 蛋白质在蛋白质在蛋白质在蛋白质在280nm280nm左右有吸收高峰，这主要是由于蛋白质中左右有吸收高峰，这主要是由于蛋白质中左右有吸收高峰，这主要是由于蛋白质中左右有吸收高峰，这主要是由于蛋白质中的芳香族氨基酸的芳香族氨基酸的芳香族氨基酸的芳香族氨基酸(Trp(Trp和和和和Tyr)Tyr)的缘故，因此可以用的缘故，因此可以用的缘故，因此可以用的缘故，因此可以用280nrn280nrn光吸光吸光吸光吸收值来定
35、量溶液中的蛋白质。但是每种蛋白质中的芳香族氨收值来定量溶液中的蛋白质。但是每种蛋白质中的芳香族氨收值来定量溶液中的蛋白质。但是每种蛋白质中的芳香族氨收值来定量溶液中的蛋白质。但是每种蛋白质中的芳香族氨基酸含量是不同的，而且有较大的差别。最简单的方法是采基酸含量是不同的，而且有较大的差别。最简单的方法是采基酸含量是不同的，而且有较大的差别。最简单的方法是采基酸含量是不同的，而且有较大的差别。最简单的方法是采用用用用280nm280nm光吸收为光吸收为光吸收为光吸收为1 1时等于时等于时等于时等于lmg/mllmg/ml来计算。这样简单的处来计算。这样简单的处来计算。这样简单的处来计算。这样简单的
36、处理在准确性上有不足之处，但其测定时间短，用量极少，而理在准确性上有不足之处，但其测定时间短，用量极少，而理在准确性上有不足之处，但其测定时间短，用量极少，而理在准确性上有不足之处，但其测定时间短，用量极少，而且不消耗样品，故被广泛采用。且不消耗样品，故被广泛采用。且不消耗样品，故被广泛采用。且不消耗样品，故被广泛采用。最准确的方法是用蛋白质的摩尔消光系数计算。在蛋白质最准确的方法是用蛋白质的摩尔消光系数计算。在蛋白质最准确的方法是用蛋白质的摩尔消光系数计算。在蛋白质最准确的方法是用蛋白质的摩尔消光系数计算。在蛋白质纯化后，将此纯的蛋白质对水充分透析，然后冻于或在真空纯化后，将此纯的蛋白质对水
37、充分透析，然后冻于或在真空纯化后，将此纯的蛋白质对水充分透析，然后冻于或在真空纯化后，将此纯的蛋白质对水充分透析，然后冻于或在真空干燥器中干燥，继而在干燥器中干燥，继而在干燥器中干燥，继而在干燥器中干燥，继而在105105下恒重，精确称量下恒重，精确称量下恒重，精确称量下恒重，精确称量110mg110mg，再定量溶于一定体积中再定量溶于一定体积中再定量溶于一定体积中再定量溶于一定体积中(通常为通常为通常为通常为1mg/ml)1mg/ml)，测量，测量，测量，测量280nm280nm下的下的下的下的光吸收，从而得出该蛋白质的摩尔消光系数。这种方法最为光吸收，从而得出该蛋白质的摩尔消光系数。这种方
38、法最为光吸收，从而得出该蛋白质的摩尔消光系数。这种方法最为光吸收，从而得出该蛋白质的摩尔消光系数。这种方法最为方便、准确，适于微量测定。方便、准确，适于微量测定。方便、准确，适于微量测定。方便、准确，适于微量测定。第十二页，讲稿共三十四页哦二、考马斯亮蓝二、考马斯亮蓝二、考马斯亮蓝二、考马斯亮蓝G250G250法法法法 此法适合于定量此法适合于定量此法适合于定量此法适合于定量1010100g100g，操作简单，应用广泛。考马，操作简单，应用广泛。考马，操作简单，应用广泛。考马，操作简单，应用广泛。考马斯亮蓝斯亮蓝斯亮蓝斯亮蓝G-250G-250又叫又叫又叫又叫“homemade”homemad
39、e”试剂，每个实验室可以方试剂，每个实验室可以方试剂，每个实验室可以方试剂，每个实验室可以方便地自行配制。便地自行配制。便地自行配制。便地自行配制。三、双缩脲法三、双缩脲法三、双缩脲法三、双缩脲法 此法是基于蛋白质之肽键一此法是基于蛋白质之肽键一此法是基于蛋白质之肽键一此法是基于蛋白质之肽键一CD-NH-CD-NH-有双缩脲反应，在碱有双缩脲反应，在碱有双缩脲反应，在碱有双缩脲反应，在碱性溶液中与性溶液中与性溶液中与性溶液中与CuCu2 2络合显蓝色。该法受蛋白质之特异性影响络合显蓝色。该法受蛋白质之特异性影响络合显蓝色。该法受蛋白质之特异性影响络合显蓝色。该法受蛋白质之特异性影响较小，适用于
40、较大量蛋白质较小，适用于较大量蛋白质较小，适用于较大量蛋白质较小，适用于较大量蛋白质(毫克级毫克级毫克级毫克级)的测定。的测定。的测定。的测定。四、福林一酚法四、福林一酚法四、福林一酚法四、福林一酚法 此法灵敏度和准确性都较高，但操作较繁琐，此外，影响此法灵敏度和准确性都较高，但操作较繁琐，此外，影响此法灵敏度和准确性都较高，但操作较繁琐，此外，影响此法灵敏度和准确性都较高，但操作较繁琐，此外，影响因素因素因素因素(譬如去垢剂干扰这一方法譬如去垢剂干扰这一方法譬如去垢剂干扰这一方法譬如去垢剂干扰这一方法)也较多。也较多。也较多。也较多。SmithSmith提出一种新提出一种新提出一种新提出一种
41、新的的的的BCABCA测定蛋白质的方法，灵敏度和重复性均佳，受干扰测定蛋白质的方法，灵敏度和重复性均佳，受干扰测定蛋白质的方法，灵敏度和重复性均佳，受干扰测定蛋白质的方法，灵敏度和重复性均佳，受干扰少，少，少，少，PiercePierce公司有商品供应。公司有商品供应。公司有商品供应。公司有商品供应。第十三页，讲稿共三十四页哦第四节第四节 蛋白质的脱盐蛋白质的脱盐(除去盐和非共价除去盐和非共价结合的小分子结合的小分子)用凝胶过滤法用凝胶过滤法(SephadexG-25(SephadexG-25或类似的介质或类似的介质)和和HPLCHPLC的凝的凝胶柱脱盐。应用这类技术时首先要考虑蛋白质的回收，
42、特别胶柱脱盐。应用这类技术时首先要考虑蛋白质的回收，特别对少量蛋白质，尤其是碱性蛋白质，则常常因载体对蛋白质对少量蛋白质，尤其是碱性蛋白质，则常常因载体对蛋白质的吸附作用而导致回收差。此时的流动相一般不能用水，而的吸附作用而导致回收差。此时的流动相一般不能用水，而推荐用推荐用0.1mol/L0.1mol/L醋酸或醋酸或0.1mol/L0.1mol/L碳酸氢铵，因为可以在冻干碳酸氢铵，因为可以在冻干过程中除去这些挥发性的盐。过程中除去这些挥发性的盐。在蛋白质纯化的最后阶段，常用挥发性溶剂在蛋白质纯化的最后阶段，常用挥发性溶剂(例例0.10.1TFA/ACN)TFA/ACN)的反相的反相HPLCH
43、PLC，则可得到无盐的蛋白质样品。，则可得到无盐的蛋白质样品。如果对某些蛋白质的回收低，建议用短柱如果对某些蛋白质的回收低，建议用短柱(例例PE-ABDPE-ABD公司公司的的RP-300RP-300柱，柱，30mmX2.1mm)30mmX2.1mm)较为理想。较为理想。比比HPLCHPLC更简单的方法是用更简单的方法是用C-18C-18的的Sek-PakSek-Pak，或用，或用MilliporeMillipore公司的超滤离心过滤管，但耗费较大。公司的超滤离心过滤管，但耗费较大。第十四页，讲稿共三十四页哦 如果蛋白质是用如果蛋白质是用SDS-PAGESDS-PAGE纯化的，则非共价结合的分
44、纯化的，则非共价结合的分子往往可以有效地除去，但又引入了子往往可以有效地除去，但又引入了SDSSDS和其他一些分子和其他一些分子(Tris(Tris，GlycineGlycine等等)。从。从SDS-PAGESDS-PAGE电泳的凝胶中回收蛋白电泳的凝胶中回收蛋白质的方法很多，但不尽如人意。质的方法很多，但不尽如人意。如采用电印迹，往往很有效。因为如采用电印迹，往往很有效。因为PVDFPVDF膜结合蛋白质的膜结合蛋白质的亲和力大大高于盐、去垢剂等小分子物质，从而达到蛋白质亲和力大大高于盐、去垢剂等小分子物质，从而达到蛋白质脱盐的目的。脱盐的目的。StoneStone推荐用三氯醋酸推荐用三氯醋酸
45、(TCA)(TCA)沉淀蛋白质而脱盐，蛋白质浓沉淀蛋白质而脱盐，蛋白质浓度度100g/ml(100g/ml(如果蛋白质浓度太低，得不到沉淀，这时可用如果蛋白质浓度太低，得不到沉淀，这时可用真空离心浓缩蛋白质的方法真空离心浓缩蛋白质的方法)，加总体积，加总体积1 19 9的的100100TCATCA，TCATCA最后浓度为最后浓度为1010，在冰浴放置，在冰浴放置30rain30rain后离心收集沉淀后离心收集沉淀物，用物，用100l100l冷丙酮洗两次，气流干燥。冷丙酮洗两次，气流干燥。第十五页，讲稿共三十四页哦第五节第五节 蛋白质的分子质量测定蛋白质的分子质量测定 近年来由于解决了分离介质的
46、刚性问题，有了近年来由于解决了分离介质的刚性问题，有了近年来由于解决了分离介质的刚性问题，有了近年来由于解决了分离介质的刚性问题，有了HPLCHPLC的凝胶过滤系的凝胶过滤系的凝胶过滤系的凝胶过滤系统统统统(例如例如例如例如WatersWaters的的的的1-601-60、1-1251-125、1-2501-250和和和和BeckmanBeckman或或或或ToyoSodaToyoSoda的的的的TSK2000SWTSK2000SW，3000SW3000SW，4000SW)4000SW)，这样测定分子质量只需，这样测定分子质量只需，这样测定分子质量只需，这样测定分子质量只需1h1h即可。即可。
47、即可。即可。但在一般实验室应用的常规方法是但在一般实验室应用的常规方法是但在一般实验室应用的常规方法是但在一般实验室应用的常规方法是SDS-PAGELSDS-PAGEL，刊，原理是在，刊，原理是在，刊，原理是在，刊，原理是在SDSSDS存在条件下，蛋白存在条件下，蛋白存在条件下，蛋白存在条件下，蛋白 质表面都携带了大量负电荷，呈杆状分子，在此质表面都携带了大量负电荷，呈杆状分子，在此质表面都携带了大量负电荷，呈杆状分子，在此质表面都携带了大量负电荷，呈杆状分子，在此情况下，不是根据蛋白质的电荷而是根据其分子形状和大小来进行分情况下，不是根据蛋白质的电荷而是根据其分子形状和大小来进行分情况下，不
48、是根据蛋白质的电荷而是根据其分子形状和大小来进行分情况下，不是根据蛋白质的电荷而是根据其分子形状和大小来进行分离。用量为离。用量为离。用量为离。用量为0.10.1lglg，这种方法误差为，这种方法误差为，这种方法误差为，这种方法误差为5 5一一一一1010，但极为简便。，但极为简便。，但极为简便。，但极为简便。凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子质量，而凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子质量，而凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子质量，而凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子质量，而SDS-PAGESDS-PAGE是测定蛋是测定蛋是测定蛋是测定蛋白质亚基的分子质量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子质
49、量，可白质亚基的分子质量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子质量，可白质亚基的分子质量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子质量，可白质亚基的分子质量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子质量，可以方便地判断样品蛋白质是否寡聚蛋白质。以方便地判断样品蛋白质是否寡聚蛋白质。以方便地判断样品蛋白质是否寡聚蛋白质。以方便地判断样品蛋白质是否寡聚蛋白质。第十六页，讲稿共三十四页哦 较新方法是用毛细管电泳较新方法是用毛细管电泳较新方法是用毛细管电泳较新方法是用毛细管电泳(凝胶筛分或无胶筛分凝胶筛分或无胶筛分凝胶筛分或无胶筛分凝胶筛分或无胶筛分)测定蛋白质的分子质测定蛋白质的分子质测定蛋白质的分子质测定蛋白质
50、的分子质量，仅需纳克量，而且还可用积分仪或电脑联机精确定量。同时此法对蛋量，仅需纳克量，而且还可用积分仪或电脑联机精确定量。同时此法对蛋量，仅需纳克量，而且还可用积分仪或电脑联机精确定量。同时此法对蛋量，仅需纳克量，而且还可用积分仪或电脑联机精确定量。同时此法对蛋白质的分辨率和准确性优于白质的分辨率和准确性优于白质的分辨率和准确性优于白质的分辨率和准确性优于SDS-PAGESDS-PAGE方法。在某一批方法。在某一批方法。在某一批方法。在某一批IL-3IL-3产品的分子质产品的分子质产品的分子质产品的分子质量测定中，用量测定中，用量测定中，用量测定中，用SDS-PAGESDS-PAGE得到均一