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1、关于亲和纯化技术第1页，讲稿共47张，创作于星期一2第九章第九章 亲和纯化技术亲和纯化技术亲和纯化技术亲和纯化技术（Affinity purificationAffinity purification）:利用生物分利用生物分子间的子间的特异性结合作用特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术的原理进行生物物质分离纯化的技术“亲和力亲和力”第2页，讲稿共47张，创作于星期一3亲和纯化技术亲和纯化技术p亲和层析亲和层析(Affinity chromatography)(Affinity chromatography)p亲和过滤（膜分离）亲和过滤（膜分离）p亲和分配（双水相萃取）亲和分配（双水相
2、萃取）p亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）p亲和沉淀（沉淀）亲和沉淀（沉淀）p亲和电泳（电泳）亲和电泳（电泳）第3页，讲稿共47张，创作于星期一4第一节第一节 亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)第4页，讲稿共47张，创作于星期一5亲和层析亲和层析第5页，讲稿共47张，创作于星期一6第一节第一节 亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)(Affinity Chromatography)（1 1）配配基基固固定定化化：配配基基与与载载体体偶偶联联，结结合合成成具具有有特特异异亲和性的分离介质。亲和性的分离介质。（2 2
3、）吸吸附附样样品品：亲亲和和层层析析介介质选择性吸附生物活性物质质选择性吸附生物活性物质.（3 3）样样品品解解吸吸：选选择择适适宜宜的的条条件件使使被被吸吸附附物物活活性性物物质解吸。质解吸。第6页，讲稿共47张，创作于星期一7一、亲和层析的一、亲和层析的原理和特点原理和特点7利利用用生生物物大大分分子子物物质质具具有有与与某某些些相相应应的的分分子子专专一一性性可可逆逆结结合合的的特特性性而而建建立的层析技术。立的层析技术。适适用用于于从从成成份份复复杂杂且且杂杂质质含含量量远远大大于于目目标标物物的的混混合物合物中提纯目标物。中提纯目标物。经经过过一一次次处处理理可可得得到到高高纯度纯度
4、活性物质活性物质 ；特特异异性性强强、分分离离效效果果好好、分离条件温和分离条件温和；亲亲和和吸吸附附剂剂通通用用性性较较差差，专用的吸附剂专用的吸附剂。第7页，讲稿共47张，创作于星期一8亲和吸附剂：亲和吸附剂：载体载体配基配基p在亲和层析中起可在亲和层析中起可逆结合的特异性物逆结合的特异性物质称为质称为配基配基（Ligand）。）。p与配基结合的层析与配基结合的层析介质称为介质称为载体载体（Matrix）。）。第8页，讲稿共47张，创作于星期一9配基-底物（Ligand-substance）配基-底物：亲和对特异性好特异性好 通用性差通用性差第9页，讲稿共47张，创作于星期一10梁山伯朱丽
5、叶杨贵妃小龙女祝英台林黛玉崔莺莺Ligand Substance祝英台第10页，讲稿共47张，创作于星期一11酶酶受体，载体蛋白受体，载体蛋白凝集素凝集素抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞谷胱甘肽谷胱甘肽聚（聚（His）融合蛋白，表面具有融合蛋白，表面具有Cys/Trp残基残基核酸核酸互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，核酸结合蛋互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，核酸结合蛋白白金属离子金属离子谷胱甘肽谷胱甘肽-S-S-转移酶，转移酶，GSTGST融合蛋白融合蛋白抗体抗体多糖类，糖蛋白，细胞表面受体，细胞多糖类，糖蛋白，细胞表面受体，细胞激素，维生素激素，维生素底物类似物，抑制剂，辅助因子底物类似物
6、，抑制剂，辅助因子底物底物 配基配基 第11页，讲稿共47张，创作于星期一12二、载体二、载体（一）、亲和层析对载体的要求：（一）、亲和层析对载体的要求：第12页，讲稿共47张，创作于星期一13（二）、常用载体（二）、常用载体 第13页，讲稿共47张，创作于星期一141 1、纤维素、纤维素p纤维素纤维素结构紧密结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。、均一性差，不利于大分子的渗入。p非特异性吸附力较强，非特异性吸附力较强，空间位阻空间位阻。p主要用于主要用于分离与核酸有关的物质分离与核酸有关的物质。第14页，讲稿共47张，创作于星期一152 2、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶p琼脂糖浓度有琼脂糖浓度有2
7、%2%、4%4%、6%6%，商品为，商品为Sepharose 2BSepharose 2B、4B4B和和6B6B（PharmaciaPharmacia）。）。p保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松疏松孔径大，流速快孔径大，流速快。pSepharose CLSepharose CL,稳定性明显增加，能在稳定性明显增加，能在pH314pH314中应用。中应用。第15页，讲稿共47张，创作于星期一16 3 3、葡聚糖凝胶：、葡聚糖凝胶：p葡聚糖凝胶孔径太小葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应用，偶联配基后，孔径更小，应用
8、受到限制。受到限制。第16页，讲稿共47张，创作于星期一174 4、聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：Bio-gel PBio-gel Pp有供化学反应的有供化学反应的酰胺基酰胺基，能制得配基含量较高的亲和能制得配基含量较高的亲和柱柱，适用于亲和势比较低的系统。，适用于亲和势比较低的系统。p pHpH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。过高或过低的溶液中酰胺基易水解。第17页，讲稿共47张，创作于星期一18 5 5、多孔玻璃珠：多孔玻璃珠：p化学与物理稳定性化学与物理稳定性较好，机械强度高。较好，机械强度高。p缺缺点点：亲亲水水性性不不强强，对对蛋蛋白白质质尤尤其其是是碱碱性性蛋蛋白白质质有有非特异
9、性吸附非特异性吸附，化学活性基团少。，化学活性基团少。第18页，讲稿共47张，创作于星期一196 6、其它载体、其它载体壳聚糖壳聚糖(Chitosan)(Chitosan)甲壳素和壳聚糖甲壳素和壳聚糖壳聚糖是甲壳素壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基的产物脱乙酰基的产物第19页，讲稿共47张，创作于星期一20三三 、亲和亲和配基配基 第20页，讲稿共47张，创作于星期一21（一）、配基的选择（一）、配基的选择 第21页，讲稿共47张，创作于星期一22（二）、配基的浓度（二）、配基的浓度 p对对亲亲和和势势比比较较低低的的系系统统（KL10-4mol/L），增增加加配配基基浓度浓度有利于吸附。有利于吸附。
10、p配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。p可以通过可以通过增加亲和柱的长度增加亲和柱的长度来提高吸附率。来提高吸附率。第22页，讲稿共47张，创作于星期一23（三）、配基偶联的位置三）、配基偶联的位置u配配基基固固定定化化时时，其其不不参参与与亲亲和和结结合合的部位与载体进行偶联的部位与载体进行偶联。AMP-SepharoseAMP-Sepharose亲和柱亲和柱腺嘌呤腺嘌呤N6-N6-氨基氨基接到载体上，对接到载体上，对脱氢酶和甘脱氢酶和甘油激酶油激酶有吸附力。有吸附力。磷酸基磷酸基接到载体上，对接到载体上，对甘油醛甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶有有吸
11、附力。吸附力。例：例：第23页，讲稿共47张，创作于星期一24（四）、配基分子的大小（四）、配基分子的大小 选用选用大分子配基大分子配基。小分子物质小分子物质作为配基，载体和作为配基，载体和配基间插入一个配基间插入一个“手臂手臂”以消除以消除空间障碍。空间障碍。第24页，讲稿共47张，创作于星期一25四、四、载体的活化与偶联载体的活化与偶联 uQ:载体在于配基偶联前为什么要载体在于配基偶联前为什么要“活化活化”？A A：载体相对：载体相对“惰性惰性”，不能直接与配基连接（不容易发生，不能直接与配基连接（不容易发生化学反应），因此在偶联前（载体与配基对接），需要对载化学反应），因此在偶联前（载体
12、与配基对接），需要对载体进行体进行“活化活化”u活化的方式有很多种第25页，讲稿共47张，创作于星期一26载体的活化的方式载体的活化的方式多糖类载体多糖类载体第26页，讲稿共47张，创作于星期一27聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法酰胺基酰胺基 +含氮化合物含氮化合物 胺衍生物胺衍生物第27页，讲稿共47张，创作于星期一28五、五、影响吸附亲和力的几个因素影响吸附亲和力的几个因素 第28页，讲稿共47张，创作于星期一29六、六、配基与间隔臂的连接配基与间隔臂的连接 u（一）、含氮配基的连接（一）、含氮配基的连接u（二）、含羧基配基的连接（二）、含羧基配基的连接u（三）、含巯基
13、配基的连接（三）、含巯基配基的连接u（四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接（四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接第29页，讲稿共47张，创作于星期一30七、七、亲和层析的吸附和洗脱亲和层析的吸附和洗脱 第30页，讲稿共47张，创作于星期一31第31页，讲稿共47张，创作于星期一32（一）、影响吸附的条件（一）、影响吸附的条件 1、亲和吸附剂及配体的性质、亲和吸附剂及配体的性质缓冲液的种类、离子强度、缓冲液的种类、离子强度、pHpH、温度和层析流速有关。、温度和层析流速有关。2、温度、温度升高会使吸附作用减弱。升高会使吸附作用减弱。3、流速、流速每小时低于每小时低于10 ml/cm10 ml/cm2
14、 2。4、上样体积、上样体积为柱床体积的为柱床体积的5%5%。第32页，讲稿共47张，创作于星期一33第33页，讲稿共47张，创作于星期一34离子效应离子效应 p配配基基与与载载体体-间间隔隔臂臂的的不不完完全全结结合合，将将无关离子基团无关离子基团引入吸附剂。引入吸附剂。p具具有有离离子子基基团团的的亲亲和和吸吸附附剂剂会会影影响响蛋白质的洗脱行为。蛋白质的洗脱行为。第34页，讲稿共47张，创作于星期一35疏水基团疏水基团p吸吸附附剂剂疏疏水水性性基基团团与与蛋蛋白白质质结结构构中中的的疏疏水水区相互吸引，形成非专一性吸附。区相互吸引，形成非专一性吸附。p疏水基团：疏水基团：（1 1）长的烃
15、链结构的）长的烃链结构的“手臂手臂”：烃链烃链（2 2）疏水性配基）疏水性配基第35页，讲稿共47张，创作于星期一36复合亲和力复合亲和力p离子效应离子效应作用，又有作用，又有疏水作用疏水作用。提高选择性提高选择性对每一具体系统找出最佳的配给浓对每一具体系统找出最佳的配给浓度、度、pH、离子强度和温度。、离子强度和温度。第36页，讲稿共47张，创作于星期一37（二）、亲和层析的洗脱（二）、亲和层析的洗脱第37页，讲稿共47张，创作于星期一38非专一性洗脱非专一性洗脱改变改变洗脱剂的洗脱剂的pH以影响电性基团的解离程度以影响电性基团的解离程度离子强度的离子强度的分步和梯度变化分步和梯度变化降低缓
16、冲液极性降低缓冲液极性第38页，讲稿共47张，创作于星期一39特殊洗脱特殊洗脱断裂方法有：断裂方法有：硫酯键硫酯键用羟胺处理用羟胺处理3030分钟；分钟；偶氮键偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理；用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理；二硫键二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等处理。用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等处理。第39页，讲稿共47张，创作于星期一40专一性洗脱专一性洗脱竞争性效应竞争性效应正洗脱正洗脱非竞争性效应非竞争性效应不能达到洗脱目的不能达到洗脱目的反竞争性效应反竞争性效应负洗脱负洗脱第40页，讲稿共47张，创作于星期一41专一性洗脱专一性洗脱竞争性效应竞争性效应，即，即ESI不如
17、不如EI稳定，稳定，增加洗脱剂中增加洗脱剂中I I，会使，会使E E洗脱下来（正洗脱）洗脱下来（正洗脱）。S（固定化配基），（固定化配基），E（酶），（酶），I（游离配基）（游离配基）第41页，讲稿共47张，创作于星期一42专一性洗脱专一性洗脱非竞争性效应非竞争性效应，即，即ESI稳定性与稳定性与EI相同，相同，I I的存的存在不影响在不影响E E对对S S的结合，用的结合，用I I不能达到洗脱的目不能达到洗脱的目的的。S（固定化配基），（固定化配基），E（酶），（酶），I（游离配基）（游离配基）第42页，讲稿共47张，创作于星期一43专一性洗脱专一性洗脱反竞争性效应反竞争性效应，即，即ESI
18、比比EI稳定，稳定，I使使E与与S结合更紧密结合更紧密。增加了酶与配基的增加了酶与配基的结合力及亲和吸附结合力及亲和吸附的选择性的选择性将将I除去除去“负洗脱负洗脱”第43页，讲稿共47张，创作于星期一44反竞争性效应反竞争性效应第44页，讲稿共47张，创作于星期一45配基的选择和洗脱条件配基的选择和洗脱条件 第45页，讲稿共47张，创作于星期一46（三）、亲和吸附剂的再生（三）、亲和吸附剂的再生p用用缓冲液充分平衡缓冲液充分平衡后即可重复使用。后即可重复使用。p亲亲和和力力下下降降，非非特特异异吸吸附附增增加加，大大多多由由变变性性蛋蛋白白沉沉积造成，用积造成，用6mol/L6mol/L脲洗柱脲洗柱。第46页，讲稿共47张，创作于星期一感感谢谢大大家家观观看看第47页，讲稿共47张，创作于星期一