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1、L o g o关于细菌内毒素检查法关于细菌内毒素检查法第一页，讲稿共十九页哦三、细菌内毒素检查法v（一）概述v1.内毒素(Endotoxin)：即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A，菌体死亡崩解后释放出来。v2.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。v3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和（1,3）-葡聚糖激。第二页，讲稿共十九页哦
2、v鲎的图片鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物“鲎试剂鲎试剂”，可以准确、快，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。行监测。第三页，讲稿共十九页哦v4.检查方法：包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争
3、议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。v5.检查的意义：注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射剂安全性的重要质量指标。第四页，讲稿共十九页哦v（二）凝胶法v1.原理：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。(限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数）v内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。v该法优点：快速、灵敏。v2.2.细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂v细菌内毒素国家标准品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价、复核、仲裁鲎试剂灵敏度。第五页，讲稿共十九页哦v细菌内毒素工作标准品（CSE）
4、：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其质量的相当效价。1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。用于鲎试剂灵敏度的复核、干扰试验及设置的各种阳性对照阳性对照。v细菌内毒素检查用水（BET水）：系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。是细菌内毒素检查专用水。v鲎试剂和鲎试剂灵敏度：a、鲎试剂的生产：利用鲎血制备而成。v鲎试剂的种类：美洲鲎试剂（LAL）、中国鲎试剂（TAL）、圆尾鲎试剂（CAL）。第六页，讲稿共十九页哦vB、鲎试剂的规格：是指每支鲎试剂的装量，如：0.1ml、0.5ml。一般来说，规格是多少就用多少细菌内毒素检查用水复溶。如：0.1ml就用0.1
5、ml细菌内毒素检查用水复溶。vC、鲎试剂标示灵敏度：细菌内毒素检查的规定条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。v细菌内毒素的限值（L）：哺乳动物对细菌内毒素的量有一定的耐受力，只有内毒素超过一定的限度，才会引起热原反应。因此内毒素的检查是一个限量检查，只要不超过限值，产品就合格。确定限值的方法从质量标准正文中查出。第七页，讲稿共十九页哦v最大有效稀释倍数（MVD）：供试品溶液被允许稀释的最大倍数供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的测定。MVD=CL/入。L：内毒素限值；c：供试品溶液浓度，当L以EU/ml表
6、示时，c=1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/u表示时，c的单位为mg/ml或u/ml，如：供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD=1例如：称取例如：称取m mg g供试品供试品VmlVml移取注射液移取注射液xmlxmlVmlVmlMVDMVD？C C最大有效最大有效Lm/v=LcLm/v=Lc样样入入,c,c样样入入/L/LEU/mgEU/mgLx/v=LMVD Lx/v=LMVD 入入,MVD,MVD入入/L/LEU/mlEU/ml第八页，讲稿共十九页哦v3.检查方法v（1）检查程序：实验试剂、仪器及用具等的准备；（除内毒素除内毒素）v确定药品的细菌内毒素限值L；v选择鲎试剂的灵
7、敏度入；v计算供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度；v鲎试剂灵敏度的复核复核；v药品与鲎试剂的相容性的初选实验（无干扰浓度初选）；v供试品的干扰实验的验证（正式干扰试验）；v供试品日常的内毒素限量检查。v在实际操作过程中，（1）（4）顺序可变，（5）（8）顺序不能变。第九页，讲稿共十九页哦v(2)实验准备vA、除去干扰：试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。vB、材料与器具：细菌内
8、毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查用水、漩涡混合器、371试管恒温仪、稀释、移液容器、试管架或试管浮板、酒精灯、消毒酒精棉球、剪刀、砂轮、镊子、封口胶布标记纸等。第十页，讲稿共十九页哦v(3)鲎试剂灵敏度的复核试验vA、复核的条件：本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。第十一页，讲稿共十九页哦vB、操作：0 0.1 1m ml l/支支规规格格鲎鲎试试剂剂原原安安瓿瓿1 18 8支支 复溶复溶0.1ml0.1ml内毒素检查用水内毒素检查用
9、水4 4支支4 4支支4 4支支4 4支支2 2支支2.0 2.0 内毒素溶液内毒素溶液1.0 1.0 内毒素溶液内毒素溶液0.5 0.5 内毒素溶液内毒素溶液0.25 0.25 内毒素溶液内毒素溶液内毒素检查用水内毒素检查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml内毒素工作标准品或国家标准品内毒素工作标准品或国家标准品内毒素检查用水溶解内毒素检查用水溶解15min15min稀稀释释371371保温保温1h1h呈阳性呈阳性呈阴性呈阴性结结果果有有效效计算鲎试剂计算鲎试剂灵敏度灵敏度 式中：式中：X X为反应终点浓度的对数值为反应终点
10、浓度的对数值(lg)(lg)。反应终点浓度是指系列递减的。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当当cc在在0.50.52.02.0时，方可用于内毒素检查，时，方可用于内毒素检查，并以并以C C 为该批鲎试剂灵敏度为该批鲎试剂灵敏度第十二页，讲稿共十九页哦v(4)(4)细菌内毒素检查细菌内毒素检查-凝胶法凝胶法-干扰试验干扰试验v按表制备溶液按表制备溶液A A、B B、C C和和D D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（大有效稀释倍数（MVDMVD）的溶液，按
11、鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。v编号编号 内毒素浓度内毒素浓度/配制配制内毒素的溶液内毒素的溶液 稀释用液稀释用液 稀释倍数稀释倍数 所含内毒素所含内毒素的浓度的浓度 平行管数平行管数 A A 无无/供试品溶液供试品溶液 2 2B B 2/2/供试品溶液供试品溶液 供试品溶液供试品溶液 1 12 24 48 8 22110.50.50.25 0.25 4 44 44 44 4 C C 2/2/检查用水检查用水 检查用水检查用水 1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4D D 无无/检查用水检查用水 2 2 第
12、十三页，讲稿共十九页哦干扰试验结果判定干扰试验结果判定v前提：前提：A A和和D D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C C的结果在鲎试剂灵敏度的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。复核范围内时，试验方为有效。v按下列计算系列溶液按下列计算系列溶液C C和和B B的反应终点浓度的几何平均值（的反应终点浓度的几何平均值（EsEs和和EtEt）。）。v Es=lg-1Es=lg-1（Xs/4)Xs/4)v Et=lg-1 Et=lg-1（Xt/4)Xt/4)v式中式中 EsEs、EtEt分别为系列溶液分别为系列溶液C C和溶液和溶液B B反应终点浓度的对
13、数值反应终点浓度的对数值(lg)(lg)。v当当EsEs在在0.52(0.52(包括包括0.5 0.5 和和22）及）及0.5Es2Es0.5Es2Es（包括（包括0.5Es0.5Es和和2Es2Es）时，认为）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVDMVD的稀释倍数下对试验有干的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过扰，应将供试品溶液进行不超过MVDMVD的进一步稀释，再重复干扰试验。的进一步稀释，再重复干扰试验。v注：注：A A为供试品溶液；为供试品溶液；B B为干扰试验系列；为干扰试验系列；C C为鲎试剂标示灵敏
14、度的对照系为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；列；D D为阴性对照。为阴性对照。第十四页，讲稿共十九页哦v（5 5）检查方法）检查方法v取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至2 2入浓度溶液入浓度溶液 v取检品取检品S S，计算，计算MVD MVD v把它稀释成把它稀释成SMVD SMVD v取鲎试剂取鲎试剂8 8支（支（0.1ml/0.1ml/支），支），2 2支作为样品检查管支作为样品检查管(S1(S1、S2)S2)，2 2支标记为阳性对照，支标记为阳性对照，2 2支为阳性产品对照，支为阳性产品对照，2 2支标记为阴性对照支标记为阴性对照第十五页，讲稿共十九页哦
15、举例举例-清开灵注射液中清开灵注射液中细菌内毒素的检查细菌内毒素的检查v设检品为设检品为S S，L=1.0EU/mlL=1.0EU/ml，选用效价为，选用效价为0.06EU/0.06EU/支、入支、入=0.06EU/ml=0.06EU/ml的鲎试剂，使用的细菌内毒素的工作标准品的的鲎试剂，使用的细菌内毒素的工作标准品的效价为效价为10 EU/10 EU/支。参数及支。参数及MVDMVD已经过预试验验证。已经过预试验验证。v操作步骤操作步骤（1 1）取）取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至内毒素的工作标准品一支，用水稀释至2 2入浓度溶液，即入浓度溶液，即E0.12.E0.12.v（2 2）计算
16、最大稀释倍数）计算最大稀释倍数MVD=L/MVD=L/入入=1.0/0.06=16=1.0/0.06=16倍倍v（3 3）取检品）取检品S S，把它稀释呈，把它稀释呈SMVDSMVD：0.2mlS+3.0ml0.2mlS+3.0ml水水 SMVD16SMVD16第十六页，讲稿共十九页哦v（4 4）取鲎试剂）取鲎试剂8 8支（支（0.1ml/0.1ml/支），两支作为样品检查管支），两支作为样品检查管(S1(S1、S2)S2)，2 2支标记为阳性对照，支标记为阳性对照，2 2支为阳性产品对照，支为阳性产品对照，2 2支标支标记为阴性对照，如下图所示记为阴性对照，如下图所示s1s1s2s2阳性对照
17、阳性对照阳性产品对照阳性产品对照阴性对照阴性对照0.1ml0.1ml水水+0.1ml+0.1ml SMVD16SMVD160.1ml0.1ml水水+0.1ml+0.1ml SMVD16SMVD160.1ml0.1ml水水+0.1ml E2+0.1ml E2入入0.1mlE20.1mlE2入入+0.1ml SMVD16+0.1ml SMVD160.2ml0.2ml水水第十七页，讲稿共十九页哦v（5 5）封闭管口，摇匀，放入）封闭管口，摇匀，放入371371的恒温水浴保温的恒温水浴保温602602分钟，取出观察结果，记录结果。分钟，取出观察结果，记录结果。v（6 6）结果的判断及处理：在阳性对照为阳性，阴性对照）结果的判断及处理：在阳性对照为阳性，阴性对照为阴性的情况下，若两支样品管均为阳性，判为不合格；为阴性的情况下，若两支样品管均为阳性，判为不合格；若两支样品管均为阴性，判为合格；若两支样品管一为阳若两支样品管均为阴性，判为合格；若两支样品管一为阳性，一为阴性，另取性，一为阴性，另取4 4支供试品复试。支供试品复试。v若阳性对照为阴性，或阴性对照为阳性的情况下，应寻找若阳性对照为阴性，或阴性对照为阳性的情况下，应寻找原因重试。原因重试。第十八页，讲稿共十九页哦感感谢谢大大家家观观看看第十九页，讲稿共十九页哦