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1、1.微生物的实验室培养微生物的实验室培养(piyng)2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数3.分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离第一页，共41页。1、培养基的种类、培养基的种类2、无菌技术的内容及方法、无菌技术的内容及方法3、分离、分离(fnl)纯化微生物的研究纯化微生物的研究思路、方法思路、方法第二页，共41页。一、培养基的成分、配制、主要种类一、培养基的成分、配制、主要种类(zhngli)(zhngli)及其应用及其应用 第三页，共41页。2培养基的主要培养基的主要(zhyo)成分成分营营养养物物质质概念概念作用作用来源来源碳碳源源能提供能提供
2、所需碳所需碳元素的元素的物物质质用于合成微生物用于合成微生物细细胞胞结结构的物构的物质质和和代代谢产谢产物物异养微生物的主异养微生物的主要能源要能源无机化合物：无机化合物：CO2、NaHCO3；有机化合物：糖有机化合物：糖类类、脂肪酸、花生粉脂肪酸、花生粉饼饼、石油等石油等第四页，共41页。氮氮源源能提供所能提供所需氮元素需氮元素的物的物质质主要用于合成、主要用于合成、蛋白蛋白质质、核酸以、核酸以及含氮代及含氮代谢产谢产物物无机化合物：无机化合物：N2、NH3、铵盐铵盐、硝酸硝酸盐盐；有机化；有机化合物：尿素、合物：尿素、牛肉膏、蛋白牛肉膏、蛋白胨胨生生长长因子因子生生长长必不必不可少的微可少
3、的微量有机物量有机物一般是一般是酶酶和核酸和核酸组组成成分成成分维维生素、氨基酸、生素、氨基酸、碱基碱基第五页，共41页。3.培养基的主要培养基的主要(zhyo)种类种类划分划分标标准准培养基种培养基种类类特点特点用途用途物理物理性性质质液体培养基液体培养基 不加凝固不加凝固剂剂工工业业生生产产、连续连续培培养养固体培养基固体培养基加入凝固加入凝固剂剂，如，如琼琼脂脂微生物分微生物分类类、鉴鉴定、定、活菌活菌计计数等数等化学化学成分成分天然培养基天然培养基含化学成分不明含化学成分不明确的天然物确的天然物质质工工业业生生产产合成培养基合成培养基 培养基成分明确培养基成分明确分分类类、鉴鉴定定第六
4、页，共41页。用用途途选择选择培培养基养基添加添加(或缺少或缺少)某种化学某种化学物物质质，以抑制不需要，以抑制不需要的微生物的生的微生物的生长长促促进进需要的微生物需要的微生物的生的生长长,培养、分离培养、分离出特定微生物出特定微生物鉴别鉴别培培养基养基在培养基中加入某种在培养基中加入某种指示指示剂剂或化学或化学药药品品鉴别鉴别不同种不同种类类的微的微生物生物第七页，共41页。第八页，共41页。第九页，共41页。结果结果常用的方法常用的方法消毒消毒仅杀死物体表面或仅杀死物体表面或内部一部分对人体内部一部分对人体有害的微生物有害的微生物(不包不包括芽孢和孢子括芽孢和孢子)灭菌灭菌杀死物体内外所
5、有杀死物体内外所有的微生物，包括芽的微生物，包括芽孢和孢子孢和孢子二、消毒二、消毒(xio d)和灭菌和灭菌煮沸消毒法、巴氏煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或消毒法、紫外线或化学化学(huxu)药物药物消毒法消毒法灼烧灭菌灼烧灭菌(mi jn)、干热灭菌干热灭菌(mi jn)、高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌(mi jn)第十页，共41页。培养基培养基培养皿培养皿空空 气气接种接种(jizhng)环环双双 手手牛牛 奶奶巴氏消毒巴氏消毒(xio d)化学化学(huxu)消消毒毒紫外线消毒紫外线消毒高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌常用的消毒方法和灭菌方法常用的消毒方法和灭菌方法第十
6、一页，共41页。三、微生物实验室培养三、微生物实验室培养(piyng)1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基步骤：、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基步骤：计算计算称量称量溶化溶化灭菌灭菌(mi jn)倒倒平板平板2、微生物接种最常用的方法中的是：、微生物接种最常用的方法中的是：平板划线法平板划线法和和稀释涂布平板法稀释涂布平板法第十二页，共41页。1、根据、根据(gnj)培养基的用途可分为培养基的用途可分为:四、土壤中分解尿素的细菌的分离四、土壤中分解尿素的细菌的分离(fnl)与计数与计数 培养基中加入某种化学物质，将允培养基中加入某种化学物质，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制许特定种类的微生物生长，同
7、时抑制或阻止或阻止(zzh)其他种类微生物生长。其他种类微生物生长。选择培养基选择培养基第十三页，共41页。Q3:培养酵母菌和霉菌培养酵母菌和霉菌(mjn)，可在培，可在培养基中加入养基中加入_以纤维素作为以纤维素作为(zuwi)唯一碳源的唯一碳源的选择培养基，可以分离分解纤维素选择培养基，可以分离分解纤维素的微生物。的微生物。Q1:分离分离(fnl)利用石蜡油的微生物，用利用石蜡油的微生物，用_的培养基的培养基Q2:分离产生蛋白酶的微生物，用分离产生蛋白酶的微生物，用_的培养基的培养基Q4:分离固氮微生物用分离固氮微生物用_的培养基。的培养基。以石蜡油作为唯一碳源以石蜡油作为唯一碳源以蛋白质
8、作为唯一氮源以蛋白质作为唯一氮源青霉素青霉素缺氮缺氮第十四页，共41页。鉴别鉴别(jinbi)培培养基养基 如：可用伊红如：可用伊红美蓝培养基鉴别饮美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否用水或乳制品中是否(sh fu)有大肠有大肠杆菌杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽属光泽)在培养基中加入某种指示剂或化学在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同药品鉴别不同(b tn)种类的微生物。种类的微生物。第十五页，共41页。2、统计菌落数目的方法、统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数
9、板，在显微镜下计一定容积数板，在显微镜下计一定容积(rngj)的样的样品中微生物数量。品中微生物数量。方法：用计数板计数。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。缺点：不能区分死菌与活菌。四、土壤中分解四、土壤中分解(fnji)尿素的细菌的分尿素的细菌的分离与计数离与计数第十六页，共41页。(2)间接计数法间接计数法(活菌计数法活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够原理：当样品的稀释度足够(zgu)高时，培养基表面生长的一个菌落，来高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中计平板上的菌落数，就能推
10、测出样品中大约含有多少活菌。大约含有多少活菌。第十七页，共41页。为了保证结果为了保证结果(ji gu)准确，一般选择准确，一般选择菌落数在菌落数在30300的平板进行计数。的平板进行计数。计算公式：计算公式：每克样品每克样品(yngpn)中中的菌株数的菌株数C代表代表(dibio)某一稀释度下平板上生长的平均菌落数某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)M代表稀释倍数代表稀释倍数第十八页，共41页。土壤取样土壤取样 样品稀释样品稀释 取样取样涂布涂布 微生物培养微生物培养 观察并记观察并记录结果录结果 细菌细菌(xjn)计数
11、计数3、细菌分离、细菌分离(fnl)与计数的实验流程与计数的实验流程第十九页，共41页。在细菌分解尿素的化学反应中，细在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的菌合成的_将尿素分解成了将尿素分解成了_。氨会使培养基的碱性氨会使培养基的碱性_，PH_。因此。因此(ync)，我们可以通，我们可以通过检测培养基过检测培养基_变化来判断该化学变化来判断该化学反应是否发生。反应是否发生。脲酶脲酶 氨氨 增强增强(zngqing)升高升高(shn o)PH 4、对分离的菌种的鉴定、对分离的菌种的鉴定第二十页，共41页。在以在以_为唯一氮源的培养基中为唯一氮源的培养基中加入加入_指示剂。培养某种细菌指示剂。培养
12、某种细菌(xjn)后，如果后，如果PH升高，指示剂将变升高，指示剂将变_，说明该细菌，说明该细菌(xjn)能够能够_。尿素尿素(nio s)酚红酚红 红红 分解分解(fnji)尿素尿素4、对分离的菌种的鉴定、对分离的菌种的鉴定第二十一页，共41页。1、纤维素酶、纤维素酶五、分解五、分解(fnji)纤维素的微生物纤维素的微生物的分离的分离纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种(sn zhn)组分，即组分，即C1酶、酶、CX酶和酶和葡萄糖苷酶。葡萄糖苷酶。纤维素纤维素纤维纤维(xinwi)二糖二糖葡萄糖葡萄糖C1酶酶Cx酶酶葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶第二十二页，共41页。(
13、1)筛选纤维素分解菌的方法是筛选纤维素分解菌的方法是_ 该方法可以通过该方法可以通过_反应反应(fnyng)直接直接筛选。筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色(yns(yns)2、纤维素分解、纤维素分解(fnji)菌的筛选菌的筛选原理原理(2)其原理是：刚果红可以与纤维素形成其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被，当纤维素被_分解后，分解后，红色复合物无法形成，出现以红色复合物无法形成，出现以_为中心的为中心的_，我们可以通过，我们可以通过_来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈第
14、二十三页，共41页。第二十四页，共41页。土壤土壤(trng)取样取样选择选择(xunz)培养培养梯度梯度(t d)稀释稀释将样品涂布到鉴别将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培纤维素分解菌的培养基上养基上挑选产生挑选产生透明圈的透明圈的菌落菌落3、分离分解纤维素的微生物的实验流程、分离分解纤维素的微生物的实验流程第二十五页，共41页。土壤土壤(trng)取样取样选择选择(xunz)培养培养涂布培养涂布培养(piyng)纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌第二十六页，共41页。分离纤维
15、素分解菌的实验过程分离纤维素分解菌的实验过程(guchng)中操作中操作有误的是有误的是()A经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上菌的培养基上B富集培养这一步可省略；但培养纤维素分解富集培养这一步可省略；但培养纤维素分解菌少菌少C经稀释培养后，用刚果红染色经稀释培养后，用刚果红染色D对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上素的培养基上A第二十七页，共41页。【解析】经选择培养后，再经稀释，才能将【解析】经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；样品涂布到鉴别纤维素分解菌
16、的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色，设置对照能证明染色，设置对照能证明(zhngmng)经富集培经富集培养的确得到了欲分离的微生物。养的确得到了欲分离的微生物。第二十八页，共41页。【资料【资料(zlio)(zlio)三】刚果红三】刚果红染色法染色法方法方法(fngf)一：先培养微生一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反物，再加入刚果红进行颜色反应应方法方法(fngf)二：在倒平板时二：在倒平板时就加入刚果红就加入刚果红第二十九页，共41页。生物生物(sh(shngwngw)柴柴油油油料油料作物作物(yul(yulio io zuwz
17、uw)植物油植物油甲甲 醇醇微生物微生物M M提取提取(tq(tq)脂肪酶脂肪酶（2010山东）生物柴油是一种可再生清洁山东）生物柴油是一种可再生清洁能源，其应用在一定程度上能够缓人类对化能源，其应用在一定程度上能够缓人类对化石燃料的消耗。科学家发现，在微生物石燃料的消耗。科学家发现，在微生物M产生产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油。物柴油。第三十页，共41页。（1）用于生产生物些油的植物油不易挥）用于生产生物些油的植物油不易挥发，宜选用发，宜选用_、_方法从油方法从油料作物中提取。料作物中提取。（2）筛选产脂肪酶的微生物）筛选产脂肪
18、酶的微生物M时，选择时，选择培养基中添加的植物油为微生物生长提培养基中添加的植物油为微生物生长提供供(tgng)_，培养基灭菌采用的，培养基灭菌采用的最适方法是最适方法是_法。法。压榨压榨(yzh)萃取萃取(cuq)碳源碳源高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌第三十一页，共41页。（3）测定培养液中微生物数量，可选用）测定培养液中微生物数量，可选用_法直接计数；从微生物法直接计数；从微生物M分离分离提取的脂肪酶通常需要检测提取的脂肪酶通常需要检测_，以，以确定其应用价值；为降低生产成本，可利用确定其应用价值；为降低生产成本，可利用_技术使脂肪酶能够重复使用。技术使脂肪酶能够重复使用。（4）若需克隆脂肪酶基
19、因）若需克隆脂肪酶基因(jyn)，可应用，可应用耐热耐热DNA聚合酶催化的聚合酶催化的_技术。技术。显微镜直接显微镜直接(zhji)计数计数酶活性酶活性固定化酶固定化酶PCR第三十二页，共41页。2、某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情、某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。此实验相关的问题。（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供菌培养提供(tgng)了了_和和_。除此之外，培养基
20、还必须含有的基本成分是除此之外，培养基还必须含有的基本成分是_和和_。（2）为了使该实验所得结果可靠，还应该同）为了使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种时在另一平板上接种_作为对照进作为对照进行实验。行实验。氮源氮源碳源碳源水水无机盐无机盐无菌水无菌水第三十三页，共41页。（3）培养）培养20小时后，观察到平板上有小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有样品中有_种细菌种细菌(xjn)。一。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌菌(xjn)污染的程度越污染的程度越_。（4）如果要检测水中是否含有大肠
21、杆菌，）如果要检测水中是否含有大肠杆菌，培养基中还应加入培养基中还应加入_。多多大大(或严重或严重(ynzhng)(ynzhng)伊红伊红美蓝美蓝第三十四页，共41页。(2010年青岛市模拟年青岛市模拟)啤酒是我们日常生活中啤酒是我们日常生活中最常见的饮料之一。生产过程大致如下：将经最常见的饮料之一。生产过程大致如下：将经过灭菌的麦芽汁充氧，接入啤酒酵母菌菌种后过灭菌的麦芽汁充氧，接入啤酒酵母菌菌种后输入发酵罐。初期，酵母菌迅速繁殖，糖度下输入发酵罐。初期，酵母菌迅速繁殖，糖度下降，酒精浓度渐渐上升，泡沫不断增多；当糖降，酒精浓度渐渐上升，泡沫不断增多；当糖度下降到一定程度度下降到一定程度(c
22、hngd)后，结束发酵；最后，结束发酵；最后分别输出有形物质和啤酒。根据上述过程，后分别输出有形物质和啤酒。根据上述过程，回答以下问题：回答以下问题：第三十五页，共41页。(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：诱变及筛选过程如下：步骤步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。线照射诱变处理。步骤步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基：制备选
23、择培养基。在基本培养基的基础上，注意添加础上，注意添加_和和调低调低pH，加琼脂，加琼脂(qingzh)后灭菌，制成后灭菌，制成固体平板。固体平板。高浓度蔗糖高浓度蔗糖(zhtng)(zhtng)(葡萄糖葡萄糖)第三十六页，共41页。步骤步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板(pngbn)。步骤步骤4：根据：根据_筛选出突筛选出突变菌。变菌。(2)上述步骤上述步骤2、3的目的分别是的目的分别是_、_。(3)酿酒过程中，经检测活菌数量适宜但却不酿酒过程中，经检测活菌数量适宜但却不产生酒精，应采取的措施是产生酒精，应采取的措施是_。是否是否(sh fu)(sh
24、fu)能在选择培养基上生长能在选择培养基上生长提供高糖和酸性提供高糖和酸性(sun xn)(sun xn)筛选环境筛选环境获得单菌落获得单菌落隔绝空气隔绝空气第三十七页，共41页。(4)秸秆的主要成分秸秆的主要成分(chng fn)为木质素、纤为木质素、纤维素和半纤维素，但是酵母菌却无法直接利维素和半纤维素，但是酵母菌却无法直接利用，原因是其用，原因是其_。缺乏缺乏(quf)(quf)相应分解酶系相应分解酶系(或缺乏或缺乏(quf)(quf)纤维素酶和半纤维素酶纤维素酶和半纤维素酶)第三十八页，共41页。(2009年宁夏年宁夏)(1)在微生物培养在微生物培养(piyng)操操作过程中，为防止杂
25、菌污染，需对培养作过程中，为防止杂菌污染，需对培养(piyng)基和培养基和培养(piyng)皿进行皿进行_(消毒、灭菌消毒、灭菌)；操作者的双手需要；操作者的双手需要进行清洗和进行清洗和_；静止空气中的细菌可；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能质变性，还能_。(2)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的测样品稀释的_。灭菌灭菌(mi(mi
26、 jn)jn)消毒消毒(xi(xio o d)d)损伤损伤DNA的结构的结构比例合适比例合适第三十九页，共41页。(3)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌状、大小等菌落特征对细菌(xjn)进行初步进行初步的的_。(4)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是方法是_。鉴定鉴定(jindng)将未接种将未接种(jizhng)的培养基在适宜的温度下的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生生第四十页，共41页。(5)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过基及其培养物必须经过_处理后才处理后才能能(cinng)丢弃，以防止培养物的扩散。丢弃，以防止培养物的扩散。灭菌灭菌(mi(mi jn)jn)第四十一页，共41页。