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1、植物细胞工程课件植物细胞工程课件 第六第六章章 植物细胞次生产物生植物细胞次生产物生产产自然条件下植物次生自然条件下植物次生代谢产物积累特点代谢产物积累特点培养系统的建立培养系统的建立培养细胞的次生培养细胞的次生代谢及产物积累代谢及产物积累植物细胞培养植物细胞培养的应用潜力的应用潜力主要内容主要内容6.1 自然条件下植物次生自然条件下植物次生 代谢产物积累特点代谢产物积累特点次生产物的主要类型次生产物的主要类型次生产物在植物体内的积累特点次生产物在植物体内的积累特点重要的植物资源重要的植物资源6.1.1 次生产物的主要类型次生产物的主要类型按照用途主要分为色素、香精、药物和按照用途主要分为色素
2、、香精、药物和酶等；酶等；按照分子结构包括生物碱、类黄酮、香按照分子结构包括生物碱、类黄酮、香豆素、蒽醌、萜类、甾体、蛋白质和多豆素、蒽醌、萜类、甾体、蛋白质和多肽等化合物。肽等化合物。已已知知的的植植物物次次生生代代谢谢产产物物大大约约有有100 100 000 000 种种，并且每年大约还有并且每年大约还有4 000 4 000 种新的化合物被发现。种新的化合物被发现。植植物物次次生生代代谢谢物物质质中中含含有有许许多多药药用用成成分分，现现代代药物中大约有药物中大约有25%25%来自于植物。来自于植物。色素：色素：类胡萝卜素：从胡萝卜、单冠毛菊、薄荷、蔷薇、万类胡萝卜素：从胡萝卜、单冠毛
3、菊、薄荷、蔷薇、万寿菊等植物的愈组织中提取。寿菊等植物的愈组织中提取。叶黄素：从胡萝卜、薄荷、蔷薇、万寿菊中提取。叶黄素：从胡萝卜、薄荷、蔷薇、万寿菊中提取。生物碱：生物碱：麻醉药品：如从颠茄根愈伤组织中提取的莨菪烷、莨麻醉药品：如从颠茄根愈伤组织中提取的莨菪烷、莨菪碱和从茎愈伤组织中提取东莨菪烷。菪碱和从茎愈伤组织中提取东莨菪烷。降压药：从鸭脚树种子愈伤组织中提取的利血平。降压药：从鸭脚树种子愈伤组织中提取的利血平。甾体：甾体：激素类药品：如性激素、可的松中的核皂甙元和从薯激素类药品：如性激素、可的松中的核皂甙元和从薯蓣愈伤组织中提取的地奥皂甙元。蓣愈伤组织中提取的地奥皂甙元。植植物物次次生
4、生代代谢谢的的概概念念是是1891年年由由Kossel明明确确提提出出的的，现现代代植植物物生生理理学学根根据据代代谢谢活活动动与与细细胞胞生生命命活活动动的的关关系系，将将植植物物代代谢谢分分为为初初生生代代谢谢和和次次生代谢。生代谢。6.1.2 次生产物在植物体内的积累特点次生产物在植物体内的积累特点植植物物初初生生代代谢谢及及其其产产物物是是维维持持细细胞胞生生命命活活动动必必需需的的，初初生生代代谢谢受受阻阻将将直直接接影影响响植物的生长和发育。植物的生长和发育。而而次次生生代代谢谢及及其其产产物物一一般般认认为为关关非非细细胞胞生命活动所必需。生命活动所必需。次次生生代代谢谢产产物物
5、是是一一类类小小分分子子有有机机化化合合物物，其其分分布布具有种、属、器官、组织以及发育阶段的特异性。具有种、属、器官、组织以及发育阶段的特异性。次次生生代代谢谢产产物物虽虽然然是是由由初初生生代代谢谢物物衍衍生生而而来来，但但与初生产物相比，产量上更加有限。与初生产物相比，产量上更加有限。次次生生代代谢谢物物只只能能由由特特定定时时期期的的特特化化细细胞胞合合成成，与与初初生生代代谢谢物物由由全全株株或或整整个个器器官官中中获获得得相相比比起起来来，其提取、纯化更加困难。其提取、纯化更加困难。在在15%的的陆陆地地植植物物中中已已发发现现5000多多种种生生物物碱碱，分分布布在在150多多个
6、个科科中中，如如：夹夹竹竹桃桃科科、罂罂粟粟科科、茜茜草草科科、茴香科和茄科等。茴香科和茄科等。蒽蒽 醌醌广广泛泛公公布布于于植植物物界界，主主要要的的科科有有：蓼蓼科科、鼠鼠李李科科和和茜茜草草科科等等。挥挥发发性性石石油油醌醌仅仅在在约约20个个科科目目的的高高等植物中发现，如凤仙花科、毛毡苔科等。等植物中发现，如凤仙花科、毛毡苔科等。6.1.3 重要的植物资源重要的植物资源树树脂脂主主要要分分布布于于艾艾菊菊属属、阿阿魏魏属属、桉桉树树、柑橘、茴香属等。柑橘、茴香属等。乳胶主要分布于木瓜属、大戟属植物中。乳胶主要分布于木瓜属、大戟属植物中。类类固固醇醇广广泛泛分分布布在在单单子子叶叶植植
7、物物中中，如如：百百合合科科、石石蒜蒜科科和和薯薯蓣蓣属属，及及双双子子叶叶植植物物中中，如：玄参科和茄属。如：玄参科和茄属。特特殊殊味味道道和和颜颜色色的的次次生生代代谢谢物物分分布布在在含含精精油油类类植植物物：如如豆豆蔻蔻、丁丁香香、柑柑桔桔、薄薄荷荷，或或含含不不可可挥挥发发性性类类脂脂的的精精油油类类植植物物：如如红红辣辣椒椒、胡胡荽荽、香香菜菜、肉肉豆豆蔻蔻和和芹芹菜菜，或或含含刺刺激激成成分分的的植植物物:如如辣辣椒椒、生生姜姜、胡胡椒椒，或或含含色色素素的的植植物物：如如姜姜黄黄，或或含含氨氨基基酸酸的的衍衍生生物物的的植植物物：如洋葱、大蒜、咖啡、可可等。如洋葱、大蒜、咖啡、
8、可可等。次级代谢物次级代谢物植物来源植物来源主要用途主要用途紫草宁紫草宁紫草紫草色素、消炎色素、消炎小檗碱小檗碱(黄连素黄连素)黄连黄连消炎，止泻消炎，止泻花青素，花黄素花青素，花黄素玫瑰茄，紫苏玫瑰茄，紫苏食用色素，抗氧化食用色素，抗氧化胡萝卜素胡萝卜素胡萝卜胡萝卜色素色素 超氧化歧化酶超氧化歧化酶(SOD)大蒜大蒜抗氧化、抗辐射、抗衰老抗氧化、抗辐射、抗衰老木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶番木瓜番木瓜消炎，肉质嫩化消炎，肉质嫩化人参皂苷人参皂苷人参人参调节免疫功能，保健调节免疫功能，保健类胰岛素类胰岛素苦瓜苦瓜治疗糖尿病治疗糖尿病紫杉醇紫杉醇 红豆杉红豆杉抗肿瘤抗肿瘤地高辛地高辛毛地黄毛地黄强心药强心
9、药利血平利血平罗夫木罗夫木降血压降血压长春花碱长春花碱长春花长春花治疗白血病治疗白血病奎宁碱奎宁碱金鸡纳金鸡纳抗疟疾抗疟疾鱼藤酮鱼藤酮鱼藤鱼藤杀虫杀虫表表1 植物来源的次生代谢物植物来源的次生代谢物没药没药胡黄连胡黄连(玄参科玄参科)颠颠茄茄毛毛曼曼陀陀罗罗莨菪（茄科）莨菪（茄科）烟草烟草 茄科茄科银杏（银杏科）银杏（银杏科）人参（五加科）人参（五加科）罂粟（罂粟科）罂粟（罂粟科）宁树宁树(楝科楝科)吐根吐根(茜草科茜草科)洋地黄洋地黄(参科参科)叶下珠叶下珠(大戟科大戟科)萝芙木萝芙木(夹竹桃科）夹竹桃科）芸香（芸香科）芸香（芸香科）狗牙花（夹竹桃科）狗牙花（夹竹桃科）6.2 培养系统的建立
10、培养系统的建立植物细胞的获取植物细胞的获取悬浮系的建立与细胞的同步化悬浮系的建立与细胞的同步化6.2.1 植物细胞的获取植物细胞的获取外植体的选择与预处理外植体的选择与预处理从外植体直接分离植物细胞从外植体直接分离植物细胞通过愈伤组织诱导获取植物细胞通过愈伤组织诱导获取植物细胞6.2.1.1 外植体的选择与预处理外植体的选择与预处理一、外植体的选择一、外植体的选择用于直接分离植物细胞的外植体，必须选用于直接分离植物细胞的外植体，必须选择适当生长期的健康植株，并选择细胞之择适当生长期的健康植株，并选择细胞之间粘连程度较小的植物组织、器官。间粘连程度较小的植物组织、器官。幼胚、胚轴、子叶是最常使用
11、的外植体。幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。叶片组织是直接分离单细胞的最好材料。叶片组织是直接分离单细胞的最好材料。（一）消毒处理（一）消毒处理（二）（二）其它处理其它处理二、外植体的预处理二、外植体的预处理预培养预培养黑暗处理黑暗处理低温或高温处理低温或高温处理萎蔫处理萎蔫处理抗氧化剂处理抗氧化剂处理高渗透压处理高渗透压处理6.2.1.2 从外植体直接分离植物细胞从外植体直接分离植物细胞机械捣碎法机械捣碎法v 方方法法：先先将将叶叶片片等等外外植植体体轻轻轻轻捣捣碎碎，然然后后通通过过过过滤滤和离心分离细胞。和离心分离细胞。v 优优点点：获获得得的的植植物物细细胞胞没没有有通通过过其其它它
12、物物质质作作用用，不不会会受受到到伤伤害害；不不需需要要经经过过质质壁壁分分离离，有有利利于于生生理理和和生化研究。生化研究。v 缺缺点点：由由于于受受到到机机械械的的作作用用，细细胞胞结结构构会会受受到到一一定定的的伤伤害害，获获得得完完整整的的细细胞胞团团或或细细胞胞数数量量少少，其其使使用用不普遍。不普遍。利利用用果果胶胶酶酶、纤纤维维素素酶酶等等处处理理，分分离离出出具有代谢活性的细胞。具有代谢活性的细胞。注注意意：该该法法不不仅仅能能降降解解中中胶胶层层，还还能能软软化细胞壁。必须对细胞给予渗透压保护。化细胞壁。必须对细胞给予渗透压保护。q 酶解法酶解法 愈愈伤伤组组织织的的要要求求
13、：松松散散性性好好、增增殖殖快快、再再生生能能力力强强。其其外外观观一一般般是是色色泽泽呈呈鲜鲜艳艳的的乳乳白白或或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。6.2.1.3 通过愈伤组织诱导获取植物细胞通过愈伤组织诱导获取植物细胞6.2.2 悬浮系的建立与细胞的同步化悬浮系的建立与细胞的同步化细胞悬浮培养系统的建立细胞悬浮培养系统的建立悬浮细胞的生长动态悬浮细胞的生长动态细胞同步化细胞同步化 悬悬浮浮培培养养(suspension(suspension culture)culture)是是细细胞胞培培养养的的基基本本方方法法，是是将将单单个个游游离离细细胞胞或或小小细细胞
14、胞团团在在液液体体培培养基中进行培养增殖的技术。养基中进行培养增殖的技术。液液体体状状态态下下便便于于细细胞胞和和营营养养物物质质的的充充分分接接触触和和交交换换，细细胞胞状状态态可可以以相相对对保保持持一一致致，因因此此有有利利于于在在细细胞胞水水平平上上进进行行各各种种遗遗传传操操作作，生生理理生生化化活活动动的的研研究，同时为植物细胞的大规模培养提供了技术基础。究，同时为植物细胞的大规模培养提供了技术基础。6.2.2.1 6.2.2.1 细胞悬浮培养系统的建立细胞悬浮培养系统的建立一一是是增增加加培培养养细细胞胞与与培培养养液液的的接接触触面面，改改善善营营养养供应；供应；二二是是在在振
15、振荡荡条条件件下下可可避避免免细细胞胞代代谢谢产产生生的的有有害害物物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。三是振荡培养可以适当改善气体的交换。悬浮培养与固体培养比较有三个优点：悬浮培养与固体培养比较有三个优点：callus150250ml flask subculture centrifuge isolation 10ml medium/1g 120rpm culture transfer 1time/3d80rpm 悬浮系的建立与继代培养悬浮系的建立与继代培养悬悬浮浮培培养养物物分分散散性性良良好好，细细胞胞团团较较小小，一
16、一般般在在30305050个个细细胞胞以以下下，在在实实际际培培养养中中很很少少有有完完全全由由单单细胞组成的植物细胞悬浮系。细胞组成的植物细胞悬浮系。均均一一性性好好，细细胞胞形形状状和和细细胞胞团团大大小小大大致致相相同同。悬悬浮浮系系外外观观为为大大小小均均一一的的小小颗颗粒粒，培培养养基基清清澈澈透透亮亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细细胞胞生生长长迅迅速速，悬悬浮浮细细胞胞的的生生长长量量一一般般2 23 3天天甚甚至更短时间便可增加一倍。至更短时间便可增加一倍。成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：良好的悬浮
17、细胞系状态良好的悬浮细胞系状态显微镜下细胞系的细胞状态显微镜下细胞系的细胞状态6.2.2.2 悬浮细胞的生长动态悬浮细胞的生长动态 根根据据不不同同培培养养时时间间的的细细胞胞数数变变化化，或或细细胞胞重重量量变变化化，即即可构成该培养体系的基本参数。可构成该培养体系的基本参数。生生长长速速率率（p p）一一般般通通过过不不同同时时间间细细胞胞密密度度（x x）的的自自然然对对数数与与起起始始密密度度（x x0 0）的的自自然然对对数数之之差差与与培培养养时时间间（t t）的比来衡量。）的比来衡量。p=p=（lnx lnxlnx lnx0 0）/t/t 单单位位体体积积的的细细胞胞重重量量测测
18、定定细细胞胞生生长长情情况况。细细胞胞重重量量采采用用鲜鲜重重和和干干重重来来衡衡量量。一一般般鲜鲜重重只只能能反反应应细细胞胞的的生生长长情情况况，而而干干重重则则在在一一定定程程度度上上反反应应了了细细胞胞质质量量。鲜鲜重重和和干干重重的的测测定定方方法法比比较较简简单单，只只需需按按一一定定体体积积取取样样，经经真真空空过过滤滤后后称称重重即即可可得得到到鲜鲜重重，然然后后在在80 80 条条件件下下烘烘干干细细胞胞至至恒恒重重即即可获得细胞干重。可获得细胞干重。起始愈伤组织的质量起始愈伤组织的质量接接种种细细胞胞密密度度：接接种种初初期期的的细细胞胞密密度度过过低低往往往往使使延延迟迟
19、期期加加长长，悬悬浮浮细细胞胞的的起起始始密密度度一一般般在在0.50.52.51052.5105个个细细胞胞/毫毫升升，低低于于这这一一密密度度则则会会使使细胞生长延迟。细胞生长延迟。培养条件：方式、温度、继代周期培养条件：方式、温度、继代周期影响悬浮细胞生长的因素：影响悬浮细胞生长的因素：6.2.2.3 细胞同步化细胞同步化 细细胞胞同同步步化化是是指指同同一一悬悬浮浮培培养养体体系系的的所所有有细细胞胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。都同时通过细胞周期的某一特定时期。植植物物细细胞胞在在悬悬浮浮培培养养中中的的游游离离性性较较差差，容容易易团团聚聚并并进进入入不不同同程程度度的的分分化
20、化状状态态，因因此此，要要达达到到完完全全同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。也也正正是是因因为为同同一一培培养养体体系系的的植植物物细细胞胞通通常常并并不不能能处处于于同同一一细细胞胞周周期期，这这种种差差异异使使悬悬浮浮细细胞胞的的分分裂裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化。代谢以及生理生化状态等更趋复杂化。通通过过一一定定的的理理化化措措施施可可以以使使同同一一体体系系中中的的细细胞胞达到相对同步化。达到相对同步化。饥饥饿饿法法：饥饥饿饿也也是是调调整整细细胞胞同同步步化化的的方方法法之之一一。在在一一个个培培养养体体系系中中，如如果果细细胞胞
21、生生长长的的基基本本成成分分丧丧失失，则则导导致致细细胞胞因因饥饥饿饿而而分分裂裂受受阻阻，从从而而停停留留在在某某一一分分裂裂时时期期，当当在在培培养养基基中中加加入入所所缺缺乏乏的的成成分分或或者者将将饥饥饿饿细细胞胞转转入入完完整整培培养养基基中中继继代代培培养养时时，则细胞分裂又可重新恢复。则细胞分裂又可重新恢复。饥饥饿饿导导致致的的细细胞胞分分裂裂受受阻阻常常常常是是使使细细胞胞不不能能合合成成DNADNA，即即不不能能进进入入S S期期，或或细细胞胞分分裂裂不不能能进进行行，即即不不能能进进入入M M期期。因因此此，通通过过饥饥饿饿法法可可以以获获得得处处于于G1G1和和G2G2期
22、的同步化细胞。期的同步化细胞。研研究究显显示示，当当细细胞胞处处于于氮氮饥饥饿饿时时，通通常常获获得得G1G1期期的的同同步步化化细细胞胞，当当细细胞胞处处于于磷磷和和碳碳饥饥饿饿时时，则则获获得得G1G1和和G2G2期的同步化细胞（期的同步化细胞（ChawlaChawla，19991999）。）。抑抑制制剂剂法法：通通过过一一些些DNADNA合合成成抑抑制制剂剂处处理理细细胞胞，使使细细胞胞滞滞留留在在DNADNA合合成成前前期期，当当解解除除抑抑制制后后，即即可可获得处于同一细胞周期获得处于同一细胞周期G1G1期的同步化细胞。期的同步化细胞。常常 用用 抑抑 制制 主主 要要 有有 5 5
23、 氟氟 脱脱 氧氧 尿尿 苷苷（5-5-flouorodeoxyuridineflouorodeoxyuridine，FudRFudR）和和 羟羟 基基 尿尿（hydoxyureahydoxyurea，HUHU）。）。通通过过抑抑制制剂剂获获得得的的同同步步化化细细胞胞基基本本处处于于同同一一个个细细胞胞周周期期，在在除除去去抑抑制制剂剂后后可可以以不不进进行行分分选选直直接接培培养养，用用羟羟基基尿尿处处理理获获得得同同步步化化细细胞胞的的方方法法在在小小麦麦、玉玉米米、西西芹芹等等植植物物细细胞胞培培养养中中均均有有成成功功应应用。用。分分选选法法：通通过过细细胞胞体体积积大大小小分分级级
24、是是直直接接将将处处于于相相同同周周期期的的细细胞胞进进行行分分选选，然然后后将将同同一一状状态态的的细细胞胞继继代代培培养养于于同同一一培培养养体体系系中中，从从而而可可能能保保持持相相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。同培养体系中的细胞具有较好的一致性。这这种种方方法法的的优优点点是是操操作作简简单单，不不影影响响细细胞胞活活力。精细度较差。力。精细度较差。常规细胞分选定方法是采用梯度离心的方法。常规细胞分选定方法是采用梯度离心的方法。流流式式细细胞胞仪仪的的使使用用可可以以大大大大提提高高分分选选效效率率和和精精确确程程度度，但但由由于于仪仪器器的的昂昂贵贵和和操操作作的的复复杂杂性性
25、的的限限制，这一技术短期内很难普遍使用。制，这一技术短期内很难普遍使用。低低温温处处理理：冷冷处处理理也也可可以以提提高高培培养养体体系系中中细细胞胞同同步步化化的的程程度度。OkamuraOkamura等等曾曾采采用用此此途途径径使使胡胡萝萝卜卜悬悬浮浮细细胞胞较较好好的的同同步步化化。梅梅兴兴国国等等（20012001）采采用用66低低温温处处理理红红豆豆杉杉细细胞胞也也获获得得较较明明显显得得同同步步化化效效果。果。6.3 培养细胞的次生代谢及产物积累培养细胞的次生代谢及产物积累培养条件下的植物细胞次生产物积累特性培养条件下的植物细胞次生产物积累特性提高细胞次生产物产量的途径提高细胞次生
26、产物产量的途径次生产物生产实例次生产物生产实例6.3.1 培养条件下的植物细胞培养条件下的植物细胞次生产物积累特性次生产物积累特性 根根据据植植物物细细胞胞生生长长与与产产物物合合成成的的关关系系可可分为三大类型分为三大类型:产物合成与细胞生长成正比。如长春花属产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等；合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等；产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌
27、类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；的植物细胞等属于此类型；产物合成在细胞生长停止以后。如紫草产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。宁的合成。q中间型中间型q非生长偶联型非生长偶联型q生长偶联型生长偶联型植物细胞生长于次生产物积累的相关性（植物细胞生长于次生产物积累的相关性（引自引自Endress REndress R，19941994 ）I组对数生长后期积累单冠毛菊花色素苷玫瑰酚醛曼陀罗属、莨菪属托品类生物碱穿心莲属内酯、倍半萜类巴戟天属蒽醌类II组快速生长期积累杨属花色素苷胡萝卜属肉桂酸III组与细胞生长平行积累长春花
28、属长春花碱烟草属烟碱藜属、商陆属-花青苷唐松草属小檗碱薯蓣属薯蓣皂甙配基白屈菜属血根碱药鼠李蒽醌IV组稳定期积累阿米属visnaginPauls红玫瑰绿原酸培养植物种属产物紫草紫草宁6.3.2 提高细胞次生产物产量的途径提高细胞次生产物产量的途径1 1选择适宜的起始材料选择适宜的起始材料 起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物部位的细胞，这选取自然状态下能够积累次生产物部位的细胞，这样的细胞经过培养以后常常具有合成目的产物的能样的细胞经过培养以后常常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。力，或比较容易诱导
29、合成目的产物。首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。2 2植物细胞的特性、细胞系的选择植物细胞的特性、细胞系的选择n次次生生代代谢谢物物的的积积累累与与培培养养细细胞胞的的分分化化程程度度之之间存在正相关。间存在正相关。u而在生长迅速、高度分散的细胞悬浮培养系统而在生长迅速、高度分散的细胞悬浮培养系统中，细胞所处的环境既无极性也无梯度，虽然可中，细胞所处的环境既无极性也无梯度，虽然可以获得迅速增长的生物量，但只有在细胞生长的以获得迅速增长的生物量，但只有在细胞生长的相对静止期才能积累较多产物。相对静止期才能积累较多产物。u愈愈伤伤组组织织的的培
30、培养养具具有有初初步步分分化化或或部部分分分分化化的的结结构构，可可以以积积累累较较多多的的产产物物，但但是是，它它在在形形成成连连续续生生产产方方面却极为不利。面却极为不利。这这些些现现象象说说明明，慢慢速速生生长长、分分化化或或部部分分分分化化的的组组织或组织团块，才能积累较多的次生产物。织或组织团块，才能积累较多的次生产物。细胞组系选择；细胞组系选择；培养细胞种群的结构大小、核培养细胞种群的结构大小、核型、代谢行为不同，可能与培养的外植体有关，型、代谢行为不同，可能与培养的外植体有关，不过大部分变化是由培养行为产生的。不过大部分变化是由培养行为产生的。实现植物细胞次生代谢的大规模工业化生
31、产，首实现植物细胞次生代谢的大规模工业化生产，首要条件是提高次生代谢物质在细胞中的含量。可要条件是提高次生代谢物质在细胞中的含量。可以通过筛选、诱变等手段获得次生代谢物合成能以通过筛选、诱变等手段获得次生代谢物合成能力稳定的高产细胞系加以解决。力稳定的高产细胞系加以解决。培培养养基基的的营营养养成成分分一一方方面面要要满满足足植植物物细细胞胞的的生生物物量量增增长长，另另一一方方面面要要使使细细胞胞能能合合成成和和积积累累次次生产物。生产物。一一般般来来说说，增增加加培培养养基基的的N N、P P和和K K的的浓浓度度能能促促进进细细胞胞生生长长，而而适适当当增增加加糖糖浓浓度度则则有有利利于
32、于次次生生产产物的合成。物的合成。2 2培养基成分的影响培养基成分的影响 培培养养基基中中加加入入外外源源前前体体物物质质，将将会会使使目目的的产产物物产产量量提提高高。选选择择适适当当的的前前体体物物质质是是相相当当重重要要的的。Fett-netoFett-neto等等在在紫紫杉杉细细胞胞培培养养生生产产紫紫杉杉醇醇的的研研究究中中，证证明明向向培培养养基基中中添添加加有有效效前前体体物物质质能能促促进进紫紫杉醇及紫杉醇烷类物质的合成和分泌。杉醇及紫杉醇烷类物质的合成和分泌。3 3前体（前体（precursorprecursor）的应用）的应用 植植物物细细胞胞次次生生代代谢谢是是一一个个复
33、复杂杂的的生生理理生生化化过过程程，对对于于某某一一目目的的产产物物来来讲讲可可能能有有多多种种前前体体物物质质，而而同同一一种种前前体体物物质质又又可可能能有有多多条条代代谢谢路路径径从从而而形形成成不不同同的的代代谢谢产产物物。因因此此，添添加加前前体体物物质质必必须须在在充充分分了了解解目目的的产产物物的的代代谢谢途途径径的的前前体体下下，针针对对其其合合成成的的关关键键生生化化过过程程进进行行前前体体物物质质添加。添加。多多数数前前体体物物质质对对细细胞胞生生长长本本身身并并不不十十分分有有利利，因此，前体物质的添加时间也常常影响培养效率。因此，前体物质的添加时间也常常影响培养效率。前
34、前体体的的浓浓度度对对产产物物合合成成速速率率也也会会有有一一定定影影响响。一一些些次次生生代代谢谢途途径径中中，过过量量的的底底物物反反而而会会产产生生反反馈抑制。馈抑制。4 4激发子（激发子（elicitorelicitor）的应用）的应用 激激发发子子也也称称诱诱导导子子，是是指指能能够够诱诱导导植植物物细细胞胞中中一一个个反反应应，并并形形成成细细胞胞特特征征性性自自身身防防御御反反应应的的分分子。子。目前使用的激发子可分为两类：目前使用的激发子可分为两类：一一类类是是非非生生物物激激发发子子 （abiotic abiotic elicitorelicitor），如如辐射、金属离子等。
35、辐射、金属离子等。另一类是生物激发子（另一类是生物激发子（biotic elicitorbiotic elicitor）。）。生生物物激激发发子子根根据据其其来来源源不不同同又又可可分分为为外外源源性性激激发发子子（exogenous exogenous elicitorelicitor）和和内内源源性性激激发发子子（endogenous endogenous elicitorelicitor）。外外源源性性激激发发子子多多来来源源于于微微生生物物，包包括括经经处处理理的的有有机机体体如如菌菌丝丝，或或微微生生物物机机体体浸浸提提物物以以及及由由微微生生物物产产生生的的多多糖糖类类、蛋蛋白白质
36、质类类以以及及脂脂肪肪酸酸类类等等。内内源源激激发发子子是是来来源源于于植植物物结结构构的的化化合合物物。如如降降解解细细胞胞壁壁的的酶酶类类、细细胞胞壁壁碎碎片片、寡寡聚聚糖糖以以及及其其它它有有机机分分子子（AkimotoAkimoto等等，19991999）。）。微生物诱导子微生物诱导子 真真菌菌（菌菌丝丝体体、细细胞胞壁壁片片段段、培培养养液液）、酵酵母菌提取液（母菌提取液（YEYE）寡糖寡糖 壳多糖、黄原胶、岩藻依聚糖、葡聚糖壳多糖、黄原胶、岩藻依聚糖、葡聚糖蛋白类蛋白类 壳多糖酶、纤维素酶、果胶酶、糖蛋白壳多糖酶、纤维素酶、果胶酶、糖蛋白第二信使第二信使 Ca2+Ca2+、cAMP
37、cAMP、茉莉酮酸及其甲氧基酯、茉莉酮酸及其甲氧基酯其他其他 有有机机酸酸（花花生生四四烯烯酸酸）、紫紫外外线线照照射射、金金属属离离子子、植植物物细细胞胞壁壁、除除草草剂剂、杀杀虫虫剂剂、液液体体石石蜡、琼脂糖、纤维素等蜡、琼脂糖、纤维素等图图 诱导子信号转导介导茉莉酸应答的诱导子信号转导介导茉莉酸应答的ORCA 转录因子的基因表达的模型转录因子的基因表达的模型 激发子促进次生产物积累与其种类和浓度有关。激发子促进次生产物积累与其种类和浓度有关。施施中中东东等等（19991999）在在南南方方红红豆豆杉杉细细胞胞培培养养中中证证明明，硝硝酸酸柿柿铵铵、硝硝酸酸银银、花花生生四四烯烯酸酸、水水
38、杨杨酸酸以以及及甲甲基基茉茉莉莉酮酮酸酸均均有有促进紫杉醇合成的作用，但其促进的效果有一定差异。促进紫杉醇合成的作用，但其促进的效果有一定差异。激发子激发子适宜浓度适宜浓度 （mmolLmmolL-1-1）与对照比提高与对照比提高 产物效率（倍）产物效率（倍）M-JAM-JA0.10.17.07.0花生四烯酸花生四烯酸0.10.16.56.5硝酸柿胺硝酸柿胺1.01.05.55.5水杨酸水杨酸0.10.14.54.5硝酸盐硝酸盐0.010.013.03.0 选选择择有有利利于于次次生生产产物物合合成成的的细细胞胞培培养养技技术术是是高高效效生生产产目目的的产产物物的的基基本本前前提提。这这里里
39、所所指指的的培培养养技技术术是是一一个个综综合合体体系系，包包括括对对反反应应器器的的选选择择和和对对培养方式的选择。培养方式的选择。5 5培养技术的选择培养技术的选择 培培养养技技术术的的选选择择不不仅仅要要考考虑虑细细胞胞生生长长和和产产物物积积累累的的效效率率，同同时时还还应应考考虑虑技技术术基基础础和和生生产产成成本本。就就目目前前的的技技术术基基础础来来讲讲，固固定定化化培培养养是是植植物物细细胞胞规规模模化化生生产产较较为为理理想想的的系系统统，在在条条件件允允许的情况下，可优先考虑。许的情况下，可优先考虑。二步培养法二步培养法先采用生长培养基以促进生物量增长，再用合成先采用生长培
40、养基以促进生物量增长，再用合成培养基促进次生代谢产物合成和积累。培养基促进次生代谢产物合成和积累。培养方式培养方式一步法一步法二步法二步法黄连细胞产生物碱量黄连细胞产生物碱量（mg/g.cell dw)14.7931.76表表 黄连细胞培养生产生物碱含量比较黄连细胞培养生产生物碱含量比较两相培养技术两相培养技术主要由培养相和分离相组成。主要由培养相和分离相组成。根据分离相的性质，两相培养可分为液液系统根据分离相的性质，两相培养可分为液液系统和液固系统。和液固系统。q液液培养系统中，分离相和培养基的化学性质和比重液液培养系统中，分离相和培养基的化学性质和比重不同，在系统中形成明显区分的两相，其分
41、离相主要使用不同，在系统中形成明显区分的两相，其分离相主要使用液体石蜡、烷类化合物、甘油等。液体石蜡、烷类化合物、甘油等。q液固系统是指提取相以固态形式存在于系统中，主要液固系统是指提取相以固态形式存在于系统中，主要通过吸附分离目的产物，目前使用的主要有活性炭、硅酸通过吸附分离目的产物，目前使用的主要有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝以及树脂等。镁载体、沸石、蚕丝以及树脂等。大大量量研研究究证证明明，游游离离植植物物细细胞胞从从生生理理特特性性和和可可能能进进入入的的分分化化程程度度来来看看，与与处处于于组组织织器器官官内内的的细细胞胞具具有有较较大大差差异异，然然而而，使使细细胞胞处处于于相相
42、对对固固定定和和分分化化状状态对次生代谢活动的高效性又是十分必要的。态对次生代谢活动的高效性又是十分必要的。除除了了研研究究细细胞胞固固定定化化化化技技术术外外，规规模模化化培培养养组组织织器器官官生生产产次次生生产产物物也也成成为为这这一一技技术术改改进进的的重重要要内内容容，特特别别是是通通过过发发根根农农杆杆菌菌转转化化、规规模模化化培培养养一一些些植植物物的的发发状状根根生生产产次次生生产产物物，已已在在人人参参、丹丹参参、紫紫草草、颠颠茄茄、黄黄芪芪等等植植物物中中进进行行了了探探索索性性研研究究，并并取取得得良良好好进进展展。此此外外，一一些些以以种种子子胚胚为为次次生生代代谢谢器
43、器官官的的植植物物的的体体细细胞胞胚胚规规模模化化培培养养用用于于次次生生产产物物的的生生产产，也也在少数植物中开展了研究。在少数植物中开展了研究。其他其他 气体：气体：O2、CO2、乙烯及其它。、乙烯及其它。6.3.3 次生产物生产实例次生产物生产实例19831983年年，日日本本三三井井石石油油化化学学工工业业公公司司在在世世界界上上首首次成功的采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。次成功的采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。此此后后，人人参参细细胞胞培培养养生生产产人人参参皂皂苷苷，黄黄连连细细胞胞培培养养生生产产小小檗檗碱碱，长长春春花花细细胞胞培培养养生生产产长长春春花花碱碱，红红豆豆杉杉
44、细细胞胞培培养养生生产产紫紫杉杉醇醇等等相相继继取取得得成成功功，迄迄今今为为止止，已已经经从从400400多多种种植植物物中中分分离离出出细细胞胞，并并通过细胞培养，获得通过细胞培养，获得600600多种化合物。多种化合物。在生物转化方面的应用在生物转化方面的应用在医药行业的应用在医药行业的应用在现代农业领域的应用在现代农业领域的应用在食品行业的应用在食品行业的应用在基础研究中的应用在基础研究中的应用6.4 植物细胞培养的应用潜力植物细胞培养的应用潜力6.4.1 在生物转化方面的应用在生物转化方面的应用生物转化生物转化(biotransformation,bioconversion)是利用生
45、物体系的催化作用，将外源底物转是利用生物体系的催化作用，将外源底物转化为产物的过程。生物体系包括各种细胞、化为产物的过程。生物体系包括各种细胞、组织、器官、原生质体、细胞器、无细胞提组织、器官、原生质体、细胞器、无细胞提取物、游离酶和固定化酶。取物、游离酶和固定化酶。利用生物细胞进行生物转化，其底物并不是利用生物细胞进行生物转化，其底物并不是营养物质经过细胞内的一系列代谢过程后产营养物质经过细胞内的一系列代谢过程后产生的，而是细胞产生的某种酶对外源底物进生的，而是细胞产生的某种酶对外源底物进行结构修饰的结果。因此，生物转化即不同行结构修饰的结果。因此，生物转化即不同于生物合成，也不同于生物降解
46、。于生物合成，也不同于生物降解。1977年年 Alfermann等等 人人 成成 功功 地地 用用 毛毛 地地 黄黄(Digitalis lanata)细细胞胞对对-甲甲基基毛毛地地黄黄毒毒苷苷的的C-12进进行行-羟羟基基化化，生生成成-甲甲基基地地高高辛辛，开开创创了利用植物细胞生物转化合成药物的先河。了利用植物细胞生物转化合成药物的先河。20世世纪纪90年年代代以以来来，利利用用植植物物培培养养物物进进行行生生物物转转化化的的研研究究迅迅速速发发展展。据据不不完完全全统统计计，已已成功应用于生物转化的植物细胞超过成功应用于生物转化的植物细胞超过40种。种。植物细胞植物细胞外源底物外源底物
47、转化产物转化产物产量产量毛地黄毛地黄-甲基毛地黄毒苷甲基毛地黄毒苷-甲基地高辛甲基地高辛800mg/(L.20d)紫苏紫苏伞形酮伞形酮伞形酮伞形酮-葡萄糖葡萄糖苷苷1600mg/(L.d)Euphobia characias牻儿醇牻儿醇 橙花醇橙花醇 10mg/(L.2h)Mallotus japonicus水杨酸水杨酸水杨苷水杨苷1200mg/(L.d)金黄亚麻金黄亚麻鬼臼毒素鬼臼毒素鬼臼毒素鬼臼毒素-葡萄葡萄糖苷糖苷294mg/(L.d)毛曼陀罗毛曼陀罗氢醌氢醌 熊果苷熊果苷7100mg/(L.3d)长春花长春花氢醌氢醌熊果苷熊果苷9200mg/(L.4d)蛇根木蛇根木氢醌氢醌熊果苷熊果苷
48、1800mg/(L.7d)高山红景天高山红景天酪醇酪醇 红景天苷红景天苷1980mg/(L.10d)表表2 悬浮细胞转化系统悬浮细胞转化系统抗抗癌癌药药物物：玫玫瑰瑰树树碱碱、长长春春花花碱碱、鬼鬼臼臼毒素、紫杉醇、喜树碱等。毒素、紫杉醇、喜树碱等。其其他他药药物物：地地高高辛辛、利利血血平平、奎奎宁宁碱碱、紫草宁、小檗碱、类胰岛素。紫草宁、小檗碱、类胰岛素。6.4.2 在医药行业的应用在医药行业的应用玫玫瑰瑰树树碱碱（5，11-二二甲甲基基-3，4-二二卡卡巴巴肼肼）具具有有对对几几种种实实验验性性异异常常新新肿肿瘤瘤具具抗抗癌癌特特性性，同同时也对人类几种癌症有效力。时也对人类几种癌症有效
49、力。Ochrosia elliptica是是法法国国常常见见的的一一种种约约1米米高高的的小小灌灌木木，能能分分泌泌黄黄色色的的玫玫瑰瑰树树碱碱和和其其他他不不同同形形式式的的植植物物碱碱。可可通通过过该该植植物物细细胞胞生生物物转转化化产产生生5-甲甲酸酸基基玫玫瑰瑰树树碱碱。O.elliptica的的培培养养基中可产生玫瑰树碱，基中可产生玫瑰树碱，9-甲酸基玫瑰树碱。甲酸基玫瑰树碱。从从Ochrosia Elliptia 中得到玫瑰树碱中得到玫瑰树碱木木聚聚素素广广泛泛分分布布于于各各种种植植物物中中，超超过过200种种木木聚聚素素已已被被记记录录，其其中中30种种表表现现出出抗抗肿瘤活性
50、。肿瘤活性。盾盾叶叶鬼鬼臼臼树树脂脂根根茎茎中中已已知知含含有有好好几几种种木木聚聚素素。其其对对人人类类好好几几种种癌癌症症有有疗疗效效，包包括括对对舌舌小小细细胞胞癌癌，睾睾丸丸癌癌,霍霍专专金金氏氏病病和和淋巴瘤组织扩散。淋巴瘤组织扩散。盾叶鬼臼根茎中获取盾叶鬼臼树脂盾叶鬼臼根茎中获取盾叶鬼臼树脂6.4.3 在现代农业领域的应用在现代农业领域的应用植物种质的保存植物种质的保存人工种子的制备人工种子的制备杀虫剂的生产杀虫剂的生产6.4.3.1 植物种质的保存植物种质的保存 种种质质资资源源低低温温保保存存（Cryopreservation）是是将植物的细胞或组织经过防冻处理后，在将植物的细