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1、SOD酶的生产指导老师：张立秋组员：高亚平 李婷 洪丽 魏颖 宋雪君SOD简介SOD是一种金属酶，含有铜和锌两种离子，需氧生物中，SOD催化使对抗体有关的超氧阴离子变成双氧水，随后被双氧水酶分解，保护机体免受超氧阴离子的影响，是一种新型的抗氧化酶。超氧化物歧化酶，别名肝蛋白，SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。目录项目一.SOD酵母菌的鉴定与筛选项目二.SOD酵母菌的发酵项目三.SOD的分离提取 SOD酵母菌的鉴定与筛选 经振荡培养后的诱变菌种运用正交试验设计的方法采用四个因素三 个水平选出最适的菌种培养基，
2、进行进一步的发酵培养。在发酵罐中加入最适培养基成分和 合适的酵母菌诱变菌种进行发酵扩培，最终获得大量的菌种和发酵产物。SOD酵母菌的发酵（1）固体培养基的制备（2）接种培养（3）液体培养基的制备（4）发酵培养，观察记录1、固体培养基的制备（1）称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。（2）溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。（3）调pH在未调pH前，先用 精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaO
3、H，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达76。（4）过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去(本实验无需过滤)。（5）分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内（6）加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。（7）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。（8）标记用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明
4、培养基名称、组别、日期。（9）灭菌 将上述培养基以105kg/cm2（15磅/英寸2），1213，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。3、液体培养基的制备1、牛肉膏蛋白胨培养基成分：牛肉、蛋白胨5g、Nag（由于没有加糖而导致未能培养出酵母菌）2、麦芽汁培养基的制备（1）破碎麦芽（不宜过碎，否则影响过滤）（2）糖化，将破碎后的麦芽加入500ml的蒸馏水，加入淀粉水解酶，在45水浴中保温30min，升温至70，保温1h，其间不断搅拌。（3）检测，用碘液检测糖化程度。糖化液未变色表示糖化完全。（4）过滤，使用多层纱布过滤糖化液，将滤液煮沸。（5）加入鸡蛋清高温后过滤
5、，（6）灭菌，在高压蒸汽灭菌锅中，121，0.1兆帕，20min4、发酵培养，观察记录10倍倍100倍倍后续又用碘液进行了染色，观察到淀粉粒，查阅资料后得知为酵母肝糖，但未记录sod的提取（1）菌液和收集，将三角瓶中的菌液分装至离心管中，3000rpm离心10min，收集沉淀用pbs缓冲液冲洗1次。菌液分装时发现酵母菌具有产气的特性，导致离心管的盖子不能盖上，故改为用少量多次的方法进行离心。（2）破碎，每克菌液加入氯仿-异丙醇（1：3）3ml，搅拌2h，3000rpm离心30min，收集上清。（3）纯化，将清液缓慢加入硫酸铵至 75%饱和度（8.7g/100ml）过程充分搅拌5至分层，离心（3
6、000rpm）取沉淀。sod的检测利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在34min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。SOD活性测定加样表式中式中:U/mLU/mL一一SODSOD酶活力单位酶活力单位;AA325325一邻苯三酚自氧化速率一邻苯三酚自氧化速率;AA325325一样液或一样液或SODSOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率酶液抑制邻苯三酚自氧化速率;V V一所加酶液或样液体积，单位为毫
7、升一所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL);(mL);D D一酶液或样液的稀释倍数一酶液或样液的稀释倍数;V V1 1一样液总体积，单位为毫升（一样液总体积，单位为毫升（mLmL）；）；m m一样液质量，单位为克（一样液质量，单位为克（g g）一反应液总体积，单位为毫升一反应液总体积，单位为毫升(mL)(mL)。计算结果保留三位有效数字。计算结果保留三位有效数字。检测数据SOD活力=电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色（呈现棕色区带）也可采取SOD活性负染色（呈现无色透明区带）。根据凝胶上电泳分离的SOD区带的着色深浅与面积大小，对样品进行半定量分析，也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。染色定位法常用于鉴定SOD，很少为了定量，主要原因是它不及化学法简便，但鉴定SOD却较化学法为优。用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白，有无同工酶，且可半定量地确定SOD的活性大小。葡聚糖凝胶电泳葡聚糖凝胶电泳染色液：考马斯亮蓝 1g 200ml甲醇 50 ml冰醋酸 加蒸馏水至500ml。（染色液的配制中含有大量有毒物质故应戴上手套）。脱色液：80ml甲醇 20ml冰醋酸 加蒸馏水至200ml （由于冰醋酸挥发性强故应密封）谢谢观看