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1、细菌的简单染色和革兰氏染色 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望球菌杆菌杆菌 弧菌弧菌 实验二实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色细菌的简单染色和革兰氏染色n n一、实验目的一、实验目的n n1.学习掌握简单染色的操作技术和无菌操作技术。n n2.理解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。n n3.了解芽孢染色机理，掌握芽孢染色的方法。二、实验原理二、实验原理-简单染色简单染色n n细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，细菌的细胞小而透明，在普通的
2、光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形适用于菌体一般形适用于菌体一般形适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。状和细菌排列的观察。状和细菌排列的观察。状和细菌排列的观察。n n常用常用碱性染料碱性染料碱性染料碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷
3、细菌细胞通常带负电荷细菌细胞通常带负电荷细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红美蓝、结晶紫、碱性复红美蓝、结晶紫、碱性复红美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解等。当细菌分解糖类产酸使培养基糖类产酸使培养基pHpH下降时，细菌所带正电
4、荷增加，此时下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用可用伊红、酸性复红伊红、酸性复红伊红、酸性复红伊红、酸性复红或或刚果红刚果红刚果红刚果红等酸性染料染色。等酸性染料染色。二、实验原理二、实验原理-简单染色简单染色n n染色前必须固定细菌染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形固定时尽量维持细胞原有的形。二、实验原理二、实验原理-革兰氏染色革兰氏染色n n革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌（G+
5、）和革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。n n革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。二、实验原理二、实验原理-革兰氏染色革兰氏染色n n革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结结晶紫晶紫进行初染，再用碘液媒染碘液媒染，然后用乙醇乙醇(或丙酮或丙酮)脱色脱色，最后用复染剂用复染剂(如番红如番红)复染复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。二、革兰氏染色机理二、革兰氏染色机
6、理n n当用当用结晶紫初染结晶紫初染结晶紫初染结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物结晶紫一碘的复合物结晶紫一碘的复合物结晶紫一碘的复合物，从而增强了染，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌两类细菌两类细菌两类细菌的脱色效果是不同的的脱色效果是不同的的脱色效果是不同的的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含
7、要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇量低，用乙醇(或丙酮或丙酮)脱色时细胞壁脱水、脱色时细胞壁脱水、使肽聚使肽聚使肽聚使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫紫紫紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、
8、类脂含量高，则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇类脂质被乙醇类脂质被乙醇类脂质被乙醇(或丙酮或丙酮或丙酮或丙酮)溶解，溶解，溶解，溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫细胞壁透性增大，使结晶紫细胞壁透性增大，使结晶紫细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易碘的复合物比较容易碘的复合物比较容易碘的复合物比较容易被洗脱出来被洗脱出来被洗脱出来被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。的红色。三、实验器材三、实验器材 n n1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌种。n n2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯
9、、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。n n3、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层瓶（香柏油和二甲苯）。四、实验方法和步骤四、实验方法和步骤细菌的简单染色细菌的简单染色细菌的简单染色细菌的简单染色n n1 1 1 1、涂片：、涂片：、涂片：、涂片：用用1%1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。分混匀涂成薄膜。n n2 2 2 2、干燥：、干燥：、干燥：、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。将
10、涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。n n3 3 3 3、固定：、固定：、固定：、固定：涂面朝上，通过微火涂面朝上，通过微火2-32-3次。次。n n4 4 4 4、染色：、染色：、染色：、染色：待玻片泠却后加结晶紫待玻片泠却后加结晶紫1-21-2滴于涂片上，覆盖涂滴于涂片上，覆盖涂面染色面染色1-21-2分钟。分钟。n n5 5 5 5、水洗：、水洗：、水洗：、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。水变无色为止（注：勿冲去菌体）。n n6 6 6 6、干燥：、干燥：、干燥：、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。自然
11、干燥，或用吸水纸吸干。n n7 7 7 7、镜检：、镜检：、镜检：、镜检：油镜观察并绘图。油镜观察并绘图。四、实验步骤四、实验步骤1、菌落形态观察：2、细菌简单染色：3、细菌革兰氏染色。注意：菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度、颜色、边缘是否规则等特征。染色过程：涂片干燥固定染色（1min）水洗干燥镜检注意事项：涂片：取菌量不能太大 干燥：自然干燥 水洗：水流不能直接冲在涂菌处滴加少量水滴加少量水挑取菌体挑取菌体涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗干燥干燥2.革兰氏染色革兰氏染色n n1 1）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/41/4处下面用记号笔分
12、别标明处下面用记号笔分别标明S S和和E E（见图示），并（见图示），并滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内。杆菌涂布在相应的区域内。2.革兰氏染色革兰氏染色n n2、干燥与固定：方法同（一）中2，3步骤n3、染色：结晶紫染色1-2分钟-水洗-碘液媒染1-2分钟-水洗-酒精脱色15-20秒-水洗-番红复染色2-3分钟-水洗-干燥-镜检记录。注意事项：n n酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短
13、还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。染色结果染色结果金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果染色结果染色结果大肠杆菌革兰氏染色结果染色结果染色结果金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果四、实验结果四、实验结果n n绘图记录观察结果显微镜放大倍数物镜放大倍数显微镜放大倍数物镜放大倍数目镜放大倍数目镜放大倍数 附：油镜的使用附：油镜的使用双目显微镜双目显微镜单目显微镜单目显微镜2.2.油镜的原理油镜的原理n n油镜的透镜很小
14、，从载玻片透过的光线通过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不
15、至因折射而璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。减弱，因此能清楚地看到物象。减弱，因此能清楚地看到物象。减弱，因此能清楚地看到物象。芽孢染色原理芽孢染色原理n n用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。芽孢染色步骤芽孢染色步骤（1 1 1 1）将培
16、养）将培养）将培养）将培养24242424小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。菌，作涂片、干燥、固定。菌，作涂片、干燥、固定。菌，作涂片、干燥、固定。（2 2 2 2）滴加）滴加）滴加）滴加3 35 5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3 3 3 3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽）用木
17、夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4 4 4 45 5 5 5分钟。分钟。分钟。分钟。（4 4 4 4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪
18、色为止。为止。为止。为止。（5 5 5 5）用番红水溶液复染）用番红水溶液复染）用番红水溶液复染）用番红水溶液复染1 1 1 1分钟，水洗至水为无色。分钟，水洗至水为无色。分钟，水洗至水为无色。分钟，水洗至水为无色。（6 6 6 6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。色。色。色。注意事项：注意事项：（1）选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。（2）加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则
19、芽孢难以着色。附：革兰染色液配方附：革兰染色液配方n n1 1草酸铵结晶紫染液草酸铵结晶紫染液A A液：结晶紫液：结晶紫(crystal violet)2g 95%(crystal violet)2g 95%酒精酒精 20ml 20ml B B液：草酸铵液：草酸铵(ammonium oxalate)0.8g(ammonium oxalate)0.8g 蒸馏水蒸馏水 80m 80m 混合混合A A、B B二液，静置二液，静置4848小时后使用。小时后使用。n n2 2卢戈氏卢戈氏(Lugol)(Lugol)碘液碘液碘片碘片 1 10g 0g 碘化钾碘化钾 2 20g 0g 蒸馏水蒸馏水 300ml 300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。待碘全溶后，加足水分即成。n n3.95%3.95%的酒精的酒精n n4.4.番红复染液番红复染液 沙黄沙黄 0.25g 95%0.25g 95%的酒精的酒精 10ml 10ml 蒸馏水蒸馏水 90ml 90ml 将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。思考题思考题n n1、在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？n n2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？n n3、芽孢染色要注意事项？