蛋白质与生物大分子的相互作用研究.ppt

上传人:wuy****n92 文档编号:77673134 上传时间:2023-03-16 格式:PPT 页数:63 大小:1.67MB
返回 下载 相关 举报
蛋白质与生物大分子的相互作用研究.ppt_第1页
第1页 / 共63页
蛋白质与生物大分子的相互作用研究.ppt_第2页
第2页 / 共63页
点击查看更多>>
资源描述

《蛋白质与生物大分子的相互作用研究.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《蛋白质与生物大分子的相互作用研究.ppt(63页珍藏版)》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、蛋白质与生物大分子的相互作用研究张雪梅检验医学院 基因的功能研究成为热点,研究的对象即为基因编码的产物蛋白质,生物功能的主要体现者和执行者。在所有生命活动中,细胞接受外源或是内源的信号,通过其特有的信号途径,调节其基因的表达,以保持其生物学特性,这其中必须涉及蛋白与蛋白、核酸的相互作用。掌握或发明研究相互 作用的方法非常重要。nucleus cytoplasm 主要内容n免疫共沉淀(Co-IP):蛋白蛋白,蛋白DNAnPulldown(亲和层析):蛋白蛋白,蛋白DNA/RNAn电泳迁移实验(EMSA):蛋白DNA/RNAn酵母双杂交系统:蛋白(X)蛋白用途:1.鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合

2、,结合位点分析;2.筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。3.原理:4.当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x,那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。一、免疫共沉淀(in vivo)Co-Immunoprecipitation,Co-IPCo-IP工作原理示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWestern blot 鉴定PAGE质谱细菌蛋白质的“protein A”可特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段Co-IP鉴定蛋白相互作用实验注意事项n 细胞裂解采用温

3、和的裂解条件(NP40、Triton-X100等);每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验摸索确定。n 确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀得到的,而并非其他非特异蛋白:1、使用单克隆抗体:多抗?2、使用对照样本或抗体(同型抗体)Structural basis of G proteincoupled receptorG protein interactions。Nature Chem Biol,2010,6:541-548(分析蛋白相互作用的位点)大鼠G蛋白耦联受体M3R G蛋白(绿色)(蓝色)(紫色)亚基G蛋白藕联受体信号转导示意图 将不同变异体的表达质粒共转染入cos-7细胞中,单

4、独转染的为对照;左图为IP前的IB,右图为IP后的IB,二者复合物为80kD(阳性结果)。图为两次独立实验的其中一次。TAK-242(Resatorvid),a Small Molecule Inhibitor of Toll-Like Receptor(TLR)4 Signaling,Binds Selectively to TLR4 and Interferes with Interactions between TLR4 and Its Adaptor Molecules.Mol Pharmacol,2011,79:34-41(鉴定)分析靶蛋白与小分子化合物的作用:The immunop

5、recipitates were separated using SDS-PAGE limmunoblotting with anti-FLAG M2 mAb or anti-HA tag mAb.lanalyzed using autoradiography.TRAM分析小分子化合物对蛋白相互作用的干扰Screening of ClpE interaction proteinsnConstruct recombinant plasmid pAE03-ClpE and transform into S.pneumoniae D39 nWestern blot for identificatio

6、nnCo-Immunoprecipitation(Co-IP)transfer 1ml()cleared lysate of D39 and D39-ClpE-GFP to a 10ml beaker separately.Add 500l protein G-agarose beads(GE),incubate for 3h at 4 on a rotating apparatus with magnetic stirrer to remove non-specifically bound proteins.Add 800l protein G-agarose beads and 2025g

7、 GFP antibody(Clontech)to the supernatant.Incubate overnight at 4 on a rotating apparatus.Wash beads five times with 1 ml PBS for 2 min each wash.Resuspend pellet in 50-80l 2 SDS sample buffer.Load 1015 l of supernatant on an SDS/polyacrylamide gel.FtsW与与ClpE的相互作用鉴定的相互作用鉴定A:IP前前GFP多抗检测多抗检测,(,(FtsW:G

8、FP)B:IP后后ClpE多抗检测多抗检测,3.D39(FtsW:GFP)C:IP前前ClpE多抗检测多抗检测 1.rClpP,3.D39(FtsW:GFP)优点:相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响。难点:需要高质量的抗体进行IP;两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;检测不到弱或瞬时的相互作用。应用:分析与蛋白质相互作用的DNADNA序列序列信息染色质免疫共沉淀(Chromatin Immuno-precipitation,ChIP)Chip-seq技术技术 可获得数百万条序列标签,并能把所关注

9、的蛋白的DNA结合位点结合位点精确定位到基因组上。华大基因、上海生物芯片有限、上海康成生物有限公司等 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.Science,2007,316(5830):1497-1502 Johnson等利用 ChIP-seq 对转录因子NRSF(神经元限制性沉默因子)在DNA上的结合位点进行了全基因组的筛查:结果:获得了1946个结合位点;结合位点的最小能分辨为50bp。获得的经典与非经典的神经限制性沉默元件(NRSE)序列。高质量的

10、ChIP-seq结果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的内容,发现其为胰岛发育调控网络中的重要转录因子。Ago1 Interacts with RNA Polymerase II and Binds to the Promoters of Actively Transcribed Genes in Human Cancer Cells.PloS Genet.2013 Sep;9(9):e1003821 Argonaute(Ago)家族蛋白:与小非编码RNAs(siRNAs,miRNAs,piRNAs)生成和功能发挥密切相关,调控蛋白质的合成或影响mRNA的稳定性;在人类肿瘤细胞中可直接或间接地

11、参与细胞周期进程的调控。二、Pull-down实验(in vitro)用途:1.鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 2.筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质原理:利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质(诱饵蛋白)固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时,可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的蛋白。洗脱洗脱(2)结合结合(3)检测检测(6)收集收集(5)洗脱洗脱(4)固定诱固定诱饵蛋白饵蛋白(1)The Polymeric Immunoglobulin ReceptorTranslocates Pneumococci a

12、cross Human Nasopharyngeal Epithelial Cells.Cell,2000,102:827837(筛选、鉴定)npolymeric immunoglobulin receptor(pIgR)nCbpA nThe hpIgR-mediated bacterial adherence and invasion were abolished by either insertional knockout of cbpA or antibodies against either hpIgR or CbpA.methodsn蛋白表达:Expression of CbpA P

13、olypeptides(6His)nPull-down:Affinity Purification of the CbpA Binding Proteinsn蛋白鉴定:Proteins in the fractions were analyzed by SDS-PAGE and IB,and N-Terminal Sequencing of the CbpA Binding ProteinsnrCbpA Covalently conjugated to 1 ml of Affi-Gel 15(BioRad)in 0.1 M MOPS(pH 7.5)at 4;nThe column was se

14、quentially washed with washing buffer;nDetroit cells surface proteins were labeled with Sulfo-NHS-LC-biotin;nCell lysates were prepared in a buffer containing protease inhibitors;nCellular debris was removed by centrifugation at 4,The supernatant was recycled through the CbpA1-affinity column for 4

15、h at 4;nwash the column with washing buffer;nthe bound proteins were eluted in 300 ml fractions with 100mM glycine-HCl(pH 2.5)。进一步鉴定hplgR与CbpA结合的区段及是否需要糖基化n rCbpA were immobilized on carboxylated latex beads.n Latex beads coated with CbpA polypeptides were resuspended in 100l of PBS/Mg2+/Ca2+and 0.1

16、%Triton X-100,and mixed with 100l of hSC(plgR胞胞外部分)外部分).n Unbound proteins were removed by extensive washing buffer.n The beads were then resuspended in SDS-PAGE loading buffer to solubilize bound proteins.n Proteins were separated in SDS-PAGE gels and detected by IB.CbpA与hplgR结合区段的鉴定 Vncs为的另一种膜蛋白,h

17、SC为表达hplgR的MDCK细胞,Neo为不表达hplgR的MDCK细胞。Pull-down的优缺点n优点:灵敏、周期短抗体质量要求不高可鉴定直接相互作用n缺点:需要纯化的蛋白体外相互作用(假阳性、假阴性)DNA/RNA Pull-down 实验n应用:主要用于筛选、筛选、鉴定鉴定与目的DNA或RNA片段相互作用的蛋白质(转录因子、翻译调控因子类)n方法:与蛋白相互作用的Pull-down类似,只是固定于色谱柱或磁珠上的为标记的DNA或RNA片段,其他步骤一样。n优缺点:相较于酵母单/三杂交,其无需构建基因文库、操作较简便、周期短。缺点与蛋白Pull-down一样。Sreening tran

18、scription regulator by DNA pull-down M:蛋白分子量;C1C4:CPS探针洗脱液14;K1K4:空载M-280免疫磁珠空白对照14。A subset of replication proteins enhances origin recognition and lytic replication by the EB virus ZEBRA protein.PLoS Pathog.2010,6(8)DNA pull downn共孵育:BZKO cells were transfected with expression vectors for the indi

19、cated forms of ZEBRA together with Biotinylated oligomers containing one of 3 regulatory regions.nPull down:The Biotinylated probes were purified from cell lysates using avidin beads.nIB:The amount of ZEBRA bound to each probe and the total amount of ZEBRA present in each lysate were assessed by wes

20、tern blot analysis.检测DNA结合的蛋白量A:upstream region of oriLyt BURB:a short region of Rp BRpS C:full length Rp BRpL Chip检测(蛋白结合的DNA量)又叫凝胶阻滞实验(Gel retardation assay)或DNA迁移率变动实验(DNA mobility shift assay)。是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点,是当前被选作鉴定特定DNA或RNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。原理:DNA/RNA分子与蛋白的

21、结合导致了电泳时迁移率的降低。三、电泳迁移实验Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)凝胶阻滞实验的基本原理图 标记的DNA片段由于与蛋白质B结合,在凝胶电泳中移动速度变慢,因而呈现滞后的条带。ACB显影或显色*凝胶电泳标记的DNA片段细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合*BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢滞后带表明DNA与蛋白质结合(a)(b)(c)在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用(a)没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验,探针DNA与特异蛋白质结合,出现阻滞条带;(b)加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质,阻滞

22、条带消失;(c)竞争DNA为其它序列,与探针DNA分别结合不同的蛋白质,则出现同(a)一样的阻滞条带。*蛋白质与未标记的竞争DNA结合凝胶电泳显影或显色蛋白质不与非标记DNA结合*Role of Adaptor TRIF in the MyD88-Independent Toll-Like Receptor Signaling Pathway.Masahiro Yamamoto,et al.Science 301,640(2003);C:50 g/mlpoly(I:C)for the indicated periods.Nuclear extracts were prepared,and NF

23、-kB DNA binding activity was determined by electrophoretic mobility shift assay(EMSA)using an NF-Bspecific probe.poly(I:C),建立的基础:真核细胞的转录因子:l DNA结合域:DNA binding domain,BDl 转录激活域:Activation domain,AD四、酵母双杂交系统yeast two-hybrid system酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交原理图UASLacZ/His报告基因表达X外源基因 BDGAL4 BD外源基因GAL4 ADADBD 质粒AD

24、质粒表达表达融合蛋白融合蛋白Y BDXYADYADRNA多聚酶 BDX酵母双杂交系统的组成n与BD融合的蛋白表达载体,表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)n与AD融合的蛋白表达载体,表达的蛋白称靶蛋白(prey或target)n带报告基因(report gene)的宿主细胞baittargettargetbait酵母双杂交技术的应用n筛选、鉴定蛋白质间的相互作用:验证预测的蛋白间相互作用、鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响、筛选蛋白的级联底物。n筛选、鉴定小分子与蛋白质之间的相互作用:鉴定干扰相互作用的分子、筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响。n筛选、鉴定核酸与蛋白质之间的相互作用:寻找靶序列的

25、结合蛋白(转录因子)。酵母双杂交技术的特点优点:n不需要抗体;n可直接得到相互作用蛋白的核酸序列;n胞内实验。缺点:n筛选工作需要构建基因文库。n假阳性结果比例较高。双报告基因三报告基因例:用酵母双杂交系统筛选与NifA(巴西固氮螺菌)相互作用的蛋白质。科学通报,2005,50(6):540-545采用的酵母双杂交系统:n酵母细胞:S.cerevisiae PJ69-4A(clontech公司)n含有3个报告基因:ade2、his3和lacZ,其中ade2基因表达最为严谨,his3和lacZ的表达相对松弛。n两个载体pGBD(诱饵)和pGAD(靶蛋白)分别含报告基因trp和leu。实验步骤:n

26、含nifA的诱饵质粒的构建及鉴定 将重组质粒pGBD-nifA转入酿酒酵母PJ69-4A中,铺于SD/-Trp,SD/-Trp/-Ade,SD/-Trp/-His+3-AT及SD/-Trp+X-Gal+BU平板上,30培养25 d.pGBD-nifA转化子在SD/-Trp和SD/-Trp+X-Gal+BU平板上有正常的菌落长出,但在X-Gal存在下不呈现蓝色,而在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His+3-AT平板上没有菌落长出,延长培养时间,仍然呈阴性结果.这说明诱饵质粒pGBD-nifA不不能能自自动动激激活活报报告告基基因因的表达,对宿主菌也没没有有毒毒性性作作用用,因此pG

27、BD-nifA可以用作诱饵质粒.n巴西固氮螺菌Sp7基因文库的构建 提取巴西固氮螺菌Sp7的染色体DNA,用Sau3A酶切后回收0.53 kb的DNA片段;然后与经BamH酶切的3个酵母双杂合系统的质粒载体pGAD1-C1,pGAD-C2及pGAD-C3分别进行连接(以确保外源片段的正确阅读),则构建成3个质粒文库,分别命名为YSPC1,YSCP2和YSCP3。n巴西固氮螺菌Sp7基因文库的筛选和阳性克隆的鉴定共转化:将基因组文库YSPC1,YSPC2和YSPC3分别与诱饵质粒pGBD-nifA共转化酵母感受态细胞,从YSPC1,YSPC2和YSPC3三个基因组文库中共分别得到1.4106,3

28、105和3.5105个共转化子.筛选阳性克隆:首先将转化产物铺于SD/-Leu/-Trp/-Ade选择培养基上进行筛选,3个文库转化物中共有168个菌落表现为Ade+;再将Ade+菌落挑出点种于SD/-Trp/-Leu+X-Gal+BU,SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His这3种不同的平板上进行筛选.最后,从3个文库中筛选到对3个报告基因ade2,his3和lacZ均能激活的阳性克隆109个。单倍体酵母的接合酵母的有性繁殖:a接合型和接合型,二者接合能形成二倍体。再转化:将这109个纯化后的质粒分别与诱饵质粒pGBD-nifA再次共转化酿酒酵母,在选

29、择性平板上进行鉴定,结果表明,只有11个组合可以同时激活3个报告基因的表达。n阳性克隆的序列鉴定及相互作用鉴定测序:结果表明这11个克隆属于4个蛋白基因:其中2个含有与转录因子调控有关的PAS结构域,另外1个基因片段含有与铁吸收有关的fhuE基因,另一个是未知蛋白。相互作用鉴定:载体互换实验和移码质粒构建实验。n已知NifA与P蛋白(glnB基因产物)有直接相互作用,但本次筛选的阳性克隆中并没有该基因。(原因:可能是由于我们在用Sau3A酶切而构建基因文库时,由于glnB基因(编码区只有336 bp)周围没有合适的Sau3A酶切位点而没有被包括进去)其它酵母杂交技术n三杂交技术(three-h

30、ybrid technology)n单杂交技术(one-hybrid technology)n反向双杂交技术(reverse two-hybrid technology)n核外双杂交技术(extranuclear two-hybrid technology)n细菌双杂交技术(bacterial two-hybrid technology)三杂交系统蛋白质(1)蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统。(2)三杂交系统小配体(筛寻小分子药物的作用蛋白)12(3)三杂交系统RNA(筛寻与已知RNA片段结合的蛋白)单杂交系统(筛寻与已知DNA结合的蛋白)1.AD融合基因文库2.已知DNA序列及下游报告基因的诱饵质粒插入酵母染色体基因组中(即诱饵序列与报告基因融合在一起)。反向双杂交系统用途:1、鉴定抑制蛋白质相互作用的小分子。2、筛选阻断蛋白质相互作用的小肽类药物。核外双杂交系统细菌双杂交系统周期短、文库容量大思考题:1.试比较pulldown、CoIP、EMSA和酵母双杂交系统的优势和劣势,分别适合用于哪些类型相互作用的检测?这些方法还可以有改良吗?还有哪些方法可以用于大分子间的相互作用?2.若想寻找某个基因的转录调控因子,可用到本节课所讲的哪些方法,试设计一条可行性较高的技术路线,筛选出转录调节子,并鉴定其与该基因的相互作用。

展开阅读全文
相关资源
相关搜索

当前位置:首页 > 教育专区 > 初中资料

本站为文档C TO C交易模式,本站只提供存储空间、用户上传的文档直接被用户下载,本站只是中间服务平台,本站所有文档下载所得的收益归上传人(含作者)所有。本站仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容本身不做任何修改或编辑。若文档所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知淘文阁网,我们立即给予删除!客服QQ:136780468 微信:18945177775 电话:18904686070

工信部备案号:黑ICP备15003705号© 2020-2023 www.taowenge.com 淘文阁