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1、第五章第五章 植物花药和花粉培养植物花药和花粉培养陈传红陈传红 制作制作本章内容提要：本章内容提要：一、概念一、概念二、花粉和花药培养技术二、花粉和花药培养技术三、花粉和花药培养应用三、花粉和花药培养应用陈传红陈传红 制作制作1 1、概念、概念单倍体细胞单倍体细胞(haploid cell)(haploid cell)：植物的花粉是花粉母细植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数只有体细胞的一半。胞经减数分裂形成的，其染色体数只有体细胞的一半。花粉和花药的培养花粉和花药的培养(pollen and anther culture)(pollen and anther culture)：
2、指：指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。单倍体植物单倍体植物(haplobionthaplobiont)：用离体培养花药的方法使用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。花粉发育成一个完整的植株。陈传红陈传红 制作制作2、花、花粉和花药粉和花药培意义培意义 诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；种周期；有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。获得无病毒个体。获得无
3、病毒个体。陈传红陈传红 制作制作3、花药培养发展简史、花药培养发展简史19641964年：年：Guha&MaheshwariGuha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成南洋金花花药培养发育成胚；胚；19671967年：年：Bourgin&NitschBourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；花药培养获得烟草植株；19731973年：年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株；我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株；目前：目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株。成植株。陈传红陈传红 制作制作 4.4.花药培养与单倍体育种花药培
4、养与单倍体育种花药培养的主要目的：花药培养的主要目的：培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源育种材料的来源。利用利用杂种花药离体培养杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来，因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，具有丰富的变异类型，选择出选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。构建构建永久性分离群体永久性分离群体双单倍体系（双单倍体系（Do
5、ubled Doubled haploid)haploid)，用于基因定位。用于基因定位。陈传红陈传红 制作制作大大缩短育种周期大大缩短育种周期陈传红陈传红 制作制作5 5、花药培养技术、花药培养技术 确定取材时间确定取材时间 选择大致处于所需要时期的花蕾选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。定花粉发育的准确时期。在水稻中，以在水稻中，以单核靠边期的花粉单核靠边期的
6、花粉对诱导单倍体植株较对诱导单倍体植株较为适宜，在外部形态上可根据为适宜，在外部形态上可根据叶枕距叶枕距为为5-15cm5-15cm，颖片，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/21/2这些条件鉴定。这些条件鉴定。陈传红陈传红 制作制作水稻花药培养操作过程水稻花药培养操作过程旗叶鞘用旗叶鞘用7070酒精擦洗一遍酒精擦洗一遍剥去旗鞘，剥去旗鞘，取出稻穗取出稻穗1010漂白粉漂白粉10 min10 min，无菌水洗一次。无菌水洗一次。7070酒精酒精手洗两遍手洗两遍培养培养5 5天后，花药变黑褐色，天后，花药变黑褐色，2020天花天花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组
7、织，药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。先形成芽，后长出根，形成幼苗。用接种环接种用接种环接种到培养基上到培养基上左手持穗，右左手持穗，右手用镊子取出手用镊子取出花药，无菌培花药，无菌培养皿中养皿中陈传红陈传红 制作制作选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。的花蕾发育良好，数量大，发育同步。操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。倍体的愈伤组织。陈传红陈传红
8、 制作制作花药培养的条件：花药培养的条件：光照光照(1218h，5,00010,000 lx，28)黑暗黑暗(12-16h，22)周期交替进行。周期交替进行。陈传红陈传红 制作制作6 6、影响花药诱导频率的因素、影响花药诱导频率的因素1 1）花粉发育时期是影响培养效果的重要因素。花粉发育时期是影响培养效果的重要因素。在诱导花粉进行雄性发育在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株发育成花粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育过程中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多数植物来说，时期不同，对多数植物来说，单核中期或晚期的花粉单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉
9、胚或花粉愈伤组织。最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大麦大麦)或单核中期或单核中期(玉米、小麦玉米、小麦)反应最好，番茄在减数分裂反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。中期时更适宜。陈传红陈传红 制作制作2 2）花药供体植株的生长条件对花药培养反）花药供体植株的生长条件对花药培养反应的影响是很大的。应的影响是很大的。水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提比分蘖
10、穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高。高。同步化程度高。同步化程度高。陈传红陈传红 制作制作3 3）培养基是花粉启动和再分化的重要条件培养基是花粉启动和再分化的重要条件我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制出研制出N N6 6培养基。在培养基。在N N6 6培养基上，培养基上，水稻花粉的出愈率大水稻花粉的出愈率大幅度提高。幅度提高。N N6 6培养基的特点是培养基的特点是铵离子浓度较低铵离子浓度较低。随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物素，研制出素，研制出C C1717和和W W1
11、414培养基，它们可以大幅度提高培养基，它们可以大幅度提高小麦小麦的花药出愈率的花药出愈率。马铃薯提取液为基本成分的马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液马铃薯培养液，现在被广，现在被广泛地应用于泛地应用于小麦花药培养小麦花药培养，效果良好。，效果良好。陈传红陈传红 制作制作 培养基中的植物生长物质种类会影响花粉发培养基中的植物生长物质种类会影响花粉发育的途径育的途径 一般在禾本科植物中，常用一般在禾本科植物中，常用1-5mg/L 2,4-D1-5mg/L 2,4-D或或NAANAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移至至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类
12、降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物质物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。形成。陈传红陈传红 制作制作 糖种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响糖种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响。朱至清等朱至清等(1990)(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21 mg/L0.21 mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导频率可增加小麦花粉胚的诱导频率可增加2-102-10倍。倍。一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长
13、而对花粉的生长无妨碍。花粉的生长无妨碍。烟草的最适蔗糖浓度为烟草的最适蔗糖浓度为3 3，水稻为，水稻为3 3-6-6，玉米，玉米则为则为1212-15-15。在培养基中加入活性炭能促进花药培养在培养基中加入活性炭能促进花药培养陈传红陈传红 制作制作4 4）低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率 以以1-51-5预低温处理小麦幼穗，能提高花粉预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的产量。在愈伤组织的产量。在44下冷冻石刁柏花蕾，预下冷冻石刁柏花蕾，预处理处理4 4天、天、8 8天和天和1212天，愈伤组织诱导率比室温天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高倍、和倍。对照
14、分别提高倍、和倍。各种植物要求预处理的温度和时间不同各种植物要求预处理的温度和时间不同。陈传红陈传红 制作制作培养温度是影响花药反应的一个重要因素。培养温度是影响花药反应的一个重要因素。小麦要求先高温培养小麦要求先高温培养6464天之后，再转入天之后，再转入28-3028-30下培养。一直高温培养效果并不好。下培养。一直高温培养效果并不好。较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织分化但愈伤组织分化白化苗的频率也高白化苗的频率也高。控制培养控制培养温度温度仍是减少白化苗的一个有效措施仍是减少白化苗的一个有效措施。陈传红陈传红 制作制作7、图示
15、花药培养过程图示花药培养过程花药材料的选取花药材料的选取 关键选取处于合适发育期的花关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。育。大多数园艺植物的花药培养，成大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核功率最高的时期为单核期，或单核中晚期中晚期。陈传红陈传红 制作制作花粉培养过程花粉培养过程选幼年树花蕾选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）取下花蕾（镜检）预培养数天预培养数天取花药取花药接种接种分离分离花粉花粉v药壁向花
16、粉提供营养物质；药壁向花粉提供营养物质；v通过药壁吸收、贮存和转化通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质培养基中的外源物质低温预处理低温预处理消毒消毒过滤离心过滤离心再生再生陈传红陈传红 制作制作单倍体植株的二倍化单倍体植株的二倍化花粉植株染色体可自发加倍；人工措施染色花粉植株染色体可自发加倍；人工措施染色体加倍。体加倍。传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋水仙素溶液处理单倍体植株，时间为水仙素溶液处理单倍体植株，时间为24-96 h24-96 h。浸泡试管苗方法浸泡试管苗方法、处理芽方法处理芽方法、浸根方法浸根方法陈传红陈传红 制作制作花药培养脱毒
17、花药培养脱毒19741974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；花药采取时期花药采取时期 单核期：花蕾单核期：花蕾4-6mm4-6mm，花药，花药1mm1mm花药诱导愈伤组织培养基花药诱导愈伤组织培养基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖蔗糖30g+30g+琼脂琼脂7g/L7g/L增殖培养基增殖培养基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖蔗糖30g+30g+琼脂琼脂7g/L7g/L生根培养基生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭活性炭3g/L+3g/L+蔗糖蔗糖20g+20g+琼脂琼脂7g/L7g/L陈传红陈传红 制作制作作业：作业：1、试论述花药培养的意义。、试论述花药培养的意义。2、详细论述花药培养方法。、详细论述花药培养方法。陈传红陈传红 制作制作