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1、硕士研究生开题报告课件 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望PTTGPTTG在鼻咽癌中的表达及在鼻咽癌中的表达及其与细胞周期的关系其与细胞周期的关系 研究生研究生:欧小波欧小波 导导 师师:陈小毅教授陈小毅教授 副副 导：赵颖海导：赵颖海 广东医学院病理教研室广东医学院病理教研室一、立题依据一、立题依据鼻咽癌鼻咽癌:遗传因素遗传因素 EBEB病毒感染病毒感染 环境化学致癌物环境化学致癌物19971997年年PeiPei等分离出垂体瘤转化等分离出垂体瘤转化
2、基因基因(PTTG)(PTTG)在鼻咽癌中的表达在鼻咽癌中的表达?在鼻咽癌发生发展在鼻咽癌发生发展?国内外还未见报道国内外还未见报道（一）有关（一）有关PTTGPTTG基因基因1.1.PTTGPTTG基因的结构基因的结构位于染色体位于染色体5q33,5q33,全长超过全长超过10kb10kb含六个外显子和五个内含子含六个外显子和五个内含子hPTTG cDNAhPTTG cDNA序列由序列由787bp787bp组成组成其作用依赖于表达水平异常其作用依赖于表达水平异常2.PTTG2.PTTG基因的表达和分布基因的表达和分布垂体肿瘤、食管癌、肺癌等高垂体肿瘤、食管癌、肺癌等高表达表达,主要位于胞质主
3、要位于胞质,部分位于胞部分位于胞核核正常组织如脾、结肠等有弱表正常组织如脾、结肠等有弱表达甚至检测不到达甚至检测不到鼻咽癌的表达情况未见报道鼻咽癌的表达情况未见报道 （二）、（二）、PTTGPTTG基因与细胞周期基因与细胞周期1.1.PTTGPTTG的细胞周期依赖性表达的细胞周期依赖性表达 Yu RYu R等发现胎盘等发现胎盘JEG-3JEG-3细胞中细胞中PTTG mRNAPTTG mRNA及蛋白的表达及蛋白的表达 G1/S G1/S期极低期极低 S S期开始升高期开始升高 G2/M G2/M期达高峰期达高峰2.2.与姐妹染色单体分离的关系与姐妹染色单体分离的关系（1 1）姐妹染色单体的分离
4、）姐妹染色单体的分离姐妹染色单体被粘合素粘着姐妹染色单体被粘合素粘着ESP1ESP1与安全子蛋白结合与安全子蛋白结合有丝分裂中后期有丝分裂中后期,APC,APC将安全子蛋将安全子蛋白泛素化而降解使白泛素化而降解使ESP1ESP1活化活化,清除清除粘合素粘合素,姐妹染色单体得以分离姐妹染色单体得以分离 安全子安全子样蛋白样蛋白ESP1ESP1图、图、PTTG PTTG与姐妹染色单体分离的关系与姐妹染色单体分离的关系粘和素粘和素后期促进后期促进复合物复合物pttgpttg安全子安全子安全子安全子蛋白蛋白(2)ESP1(2)ESP1基因基因ESP1ESP1基因定位于基因定位于号染色体号染色体,全长全
5、长6662bp,6662bp,蛋白质的蛋白质的N N端和端和hPTTGhPTTG高度高度亲和亲和罗勇军等证明了在罗勇军等证明了在G2/MG2/M期期ESP1ESP1活活化使姐妹染色单体分离化使姐妹染色单体分离 (3)PTTG(3)PTTG致瘤作用致瘤作用PTTGPTTG与安全子有同源性与安全子有同源性,过量表过量表达突变型的安全子样蛋白达突变型的安全子样蛋白,在有在有丝分裂中期不能降解丝分裂中期不能降解突变型的安全子样蛋白与突变型的安全子样蛋白与ESP1ESP1结结合合,阻止阻止ESP1ESP1清除粘合素清除粘合素,抑制姐抑制姐妹染色单体分离妹染色单体分离,促非整倍体形促非整倍体形成成,导致肿
6、瘤发生导致肿瘤发生安全子安全子样蛋白样蛋白ESP1ESP1图、图、PTTG PTTG与姐妹染色单体分离的关系与姐妹染色单体分离的关系粘和素粘和素后期促进后期促进复合物复合物pttgpttg安全子安全子安全子安全子蛋白蛋白?鼻咽癌鼻咽癌PTTGPTTG有否抑制姐妹染色单体分离有否抑制姐妹染色单体分离?与与ESP1ESP1关系如何关系如何?是否形成非整倍体是否形成非整倍体?3.3.有丝分裂检测点有丝分裂检测点 研究表明大多数肿瘤表现出有丝分研究表明大多数肿瘤表现出有丝分裂检测点功能缺陷裂检测点功能缺陷染色体未能与纺垂体正确结合时染色体未能与纺垂体正确结合时,纺垂体装配检测点系统被激活将有纺垂体装配
7、检测点系统被激活将有丝分裂阻断于中后期丝分裂阻断于中后期?PTTGPTTG抑制姐妹染色单体分离抑制姐妹染色单体分离,子子代细胞非整倍体形成进一步发展代细胞非整倍体形成进一步发展为肿瘤的过程中是否涉及检测点为肿瘤的过程中是否涉及检测点功能缺陷功能缺陷?(三三)PTTG)PTTG的调控因子的调控因子HeaneyHeaney等发现等发现,予雌激素予雌激素,PTTG,PTTG表表达呈时间、剂量依赖方式增高达呈时间、剂量依赖方式增高雌激素通过旁分泌诱导雌激素通过旁分泌诱导PTTGPTTG表达表达诱发成瘤作用诱发成瘤作用抑制雌激素则阻止肿瘤的生成抑制雌激素则阻止肿瘤的生成,减减少肿瘤细胞中少肿瘤细胞中PT
8、TGPTTG的表达的表达安全子安全子样蛋白样蛋白ESP1ESP1图、图、PTTG PTTG与姐妹染色单体分离的关系与姐妹染色单体分离的关系粘和素粘和素后期促进后期促进复合物复合物pttgpttg安全子安全子安全子安全子蛋白蛋白研究目的研究目的研研究究PTTGPTTG在在鼻鼻咽咽癌癌中中的的表表达达及及其其与与细细胞胞周周期期的的关关系系,从从细细胞胞周周期期角度探讨鼻咽癌的发生的机制角度探讨鼻咽癌的发生的机制研研究究影影响响PTTGPTTG表表达达和和活活性性的的调调 控因子控因子拟解决问题拟解决问题PTTGPTTG、ESP1ESP1基基因因的的mRNAmRNA和和蛋蛋白白在在鼻鼻咽癌中的表达
9、情况及其相关性咽癌中的表达情况及其相关性PTTGPTTG对对鼻鼻咽咽癌癌细细胞胞DNADNA含含量量、倍倍体体和有丝分裂检测点功能的影响和有丝分裂检测点功能的影响二、研究内容二、研究内容(一一)慢性鼻咽炎慢性鼻咽炎 鼻咽癌原发灶鼻咽癌原发灶 淋巴结转移灶淋巴结转移灶 PTTG PTTG、ESP1ESP1的表达的表达 DNA DNA含量和倍体分析含量和倍体分析(二二)鼻咽癌细胞系中鼻咽癌细胞系中 PTTGPTTG、ESP1ESP1的表达情况的表达情况 DNA DNA含量和倍体分析含量和倍体分析 有丝分裂检测点功能测定有丝分裂检测点功能测定(三三)体外培养细胞应用乙烯雌酚体外培养细胞应用乙烯雌酚
10、观察其对观察其对PTTGPTTG、ESP1ESP1的影响的影响三、技术路线三、技术路线q分组分组q技术路线图技术路线图q检测方法检测方法（一）（一）分分 组组1.1.临床标本：临床标本：分慢性鼻咽炎分慢性鼻咽炎 低分化鼻咽癌低分化鼻咽癌 鼻咽癌淋巴结转移灶鼻咽癌淋巴结转移灶 每组各每组各3030例例 2.2.鼻咽癌细胞系：鼻咽癌细胞系：CNE1 CNE1 CNE-2Z CNE-2Z CNE-2Z-H5 CNE-2Z-H53.3.乙烯雌酚体外实验：乙烯雌酚体外实验：CNE1 CNE1 CNE2Z CNE2Z CNE2Z-H5 CNE2Z-H5 给予乙烯雌酚给予乙烯雌酚1010-8-8M M(二)
11、技术路线图技术路线图临床标本实验临床标本实验:体外实验体外实验:慢性炎慢性炎 原发灶原发灶转移灶转移灶CNE-2ZCNE-2Z-H5 CNE1PTTGPTTGmRNAmRNA和和蛋白蛋白ESP1ESP1mRNAmRNA和和蛋白蛋白 图象分图象分析析:DNADNA含含量和倍量和倍体分析体分析乙烯雌酚(+)乙烯雌酚(-)PTTGPTTGmRNAmRNA和和蛋白的蛋白的表达情表达情况况ESP1ESP1mRNAmRNA和和蛋白的蛋白的表达情表达情况况图图象象分分析析:DNADNA含含量量和和倍倍体分析体分析周周期期阻阻断断、有有丝丝分分裂裂检检测测点点功功能能测测定定综合分析结果(三三)检测方法检测方
12、法PTTGPTTG检测检测 RT-PCR RT-PCR 原位杂交原位杂交 免免疫疫组组织织化学化学 Western Western blot blot ESP1ESP1检测检测 原位杂交原位杂交 免疫组织化学免疫组织化学 DNADNA含量和倍体分析含量和倍体分析:图象分析技术图象分析技术四、预期结果四、预期结果(1)临临 床床 标标 本本 中中 PTTGPTTG高高 表表 达达，与与 ESP1ESP1有有相相关关性性；鼻鼻咽咽癌癌存存在在非非整倍体整倍体,与与PTTGPTTG有相关性有相关性(2)(2)在鼻咽癌细胞系中在鼻咽癌细胞系中 pttgpttg和和esp1esp1的的表表达达均均呈呈细
13、细胞胞周周期期依依赖赖,两两者者存存在在相相关关性性；鼻鼻咽咽癌癌各细胞株各细胞株PTTGPTTG的表达有差异的表达有差异 低低分分化化的的鼻鼻咽咽癌癌细细胞胞有有非非整整倍倍体体,有有丝丝分分裂裂检检测测点点存存在在一一定定程程度度的缺陷的缺陷,都与都与PTTGPTTG有相关性有相关性 雌激素作用下雌激素作用下,PTTG,PTTG表达增加表达增加五、进度安排五、进度安排2005.07-2005.08 2005.07-2005.08 收集资料、写开题报告收集资料、写开题报告 和综述和综述2006.01-2006.03 2006.01-2006.03 收集标本收集标本,培养细胞培养细胞 2006
14、.04-2006.10 2006.04-2006.10 完成临床和体外实验完成临床和体外实验 检测相关指标检测相关指标2006.11-2006.12 2006.11-2006.12 处理和统计数据处理和统计数据2007.01-2007.04 2007.01-2007.04 撰写论文、答辩撰写论文、答辩 六、经费预算六、经费预算 细胞培养细胞培养 2000 2000 免疫组化免疫组化 3000 3000 原位杂交原位杂交 3000 3000 Western blot 3000 Western blot 3000 RT-PCR 4000 RT-PCR 4000 其他预算其他预算 3000 3000 合计合计 18000 18000