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1、14 基因工程基因工程基因工程基因工程（DNA recombination）：又称）：又称DNA重组技术重组技术（gene engineering），是指将外源是指将外源基因基因通过体外重组通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达复制和表达的的技术。技术。分子克隆分子克隆（molecular cloning）：是指将目的）：是指将目的DNA片段片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制复制、扩增，以获得该扩增，以获得该DNA分子大量拷贝的技术。分子大量拷贝的技术。24.1 工具酶工具酶1
2、.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2.DNA聚合酶聚合酶3.DNA连接酶连接酶4.碱性磷酸酶碱性磷酸酶5.T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶6.核酸酶核酸酶S131、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA特特定核苷酸序列的核酸水解酶。定核苷酸序列的核酸水解酶。4第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第
3、四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶限制性核酸内切酶命名限制性核酸内切酶命名5作用作用 三种限制性核酸内切酶的作用三种限制性核酸内切酶的作用酶活性酶活性 核酸内切酶核酸内切酶 核酸内切酶核酸内切酶 核酸内切酶核酸内切酶 甲基化酶甲基化酶 甲基化酶甲基化酶 ATPATP酶酶 DNADNA解旋酶解旋酶DNADNA链上的链上的 无无 有有 有有特异识别位点特异识别位点DNADNA链上的链上的 无无 在识别序列内在识别序列内 在
4、识别序列外在识别序列外特异切割位点特异切割位点在分子克隆中在分子克隆中 无无 有有 无无的重要意义的重要意义6限制酶能识别双链限制酶能识别双链DNA特异的特异的4 8个碱基对个碱基对，并在此序列内并在此序列内特异切割特异切割DNA。限制酶功能：根据需要在限制酶功能：根据需要在特定的位点特定的位点上精确切上精确切割双链割双链DNA分子。分子。回文结构回文结构（palindrome structure）：）：指双链指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。制酶所识别）。限制性核酸内切酶的作用限制性核酸内切酶的作用75 GAATTC3
5、ATATGC5 3 EcoR的识别序列：的识别序列：对称轴对称轴3 CTTAAG5 8粘性末端粘性末端（sticky end）：）：指限制酶错位切开两条对称轴互指限制酶错位切开两条对称轴互补补DNA双链所产生的末端。双链所产生的末端。平末端平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。双链所产生的末端。GAATTCCTTAAGEcoRCCC GGGGGG CCCSma9101112同工异源酶同工异源酶（isoschizomers）：指）：指来源不同，但能识别和切来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。割同一位点的酶。同尾酶同
6、尾酶（isocaudarner）：指识别序列不同，但能产生相同粘）：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。性末端的酶。如：如：BamH 和和Bst（G GATCC）Xho 和和 Pae R7（C TCGAG）如：如：BamH（G GATC C）Sau 3A（N GATC N）。）。由此产生的由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在片段可借粘性末端相互连接，在DNA重重组时具有更大的灵活性。组时具有更大的灵活性。131）DNA聚合酶聚合酶和和Klenow片段片段大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶（E.Coli DNA polymerase）是单一多肽链的多功能酶，分）是单一多肽链的多功能
7、酶，分子量为子量为103kD，它具有，它具有3种酶活性：种酶活性：5 3 DNA聚合酶活性聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性2、DNA聚合酶聚合酶 14 5 3 外切酶外切酶 5 3 聚合酶聚合酶 3 5 外外切酶切酶 (103kD)Klenow 片段片段 N C 5 3 聚合酶聚合酶 3 5 外切外切酶酶(68kD)35kD(小小)68kD(大大)N枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶 DNA聚合酶聚合酶 15补齐双链补齐双链DNA的的3 末端，同时可使末端，同时可使3 末端末端DNA标记上同位素。标记上同位素。cDNA克隆中，合成克隆中，合成cD
8、NA第二链。第二链。DNA序列分析。序列分析。Klenow片段的主要用途片段的主要用途16Taq DNA聚合酶聚合酶（简称（简称Taq 酶）是一种耐热的酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度，最佳作用温度是是7080，Taq酶具有酶具有5 3 聚合酶活性聚合酶活性和和依赖于聚合作用的依赖于聚合作用的5 3 外切酶活性外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶测序及通过聚合酶链反应（链反应（PCR）对）对DNA分子的特定序列进行体分子的特定序列进行体外扩增。外扩增。2）Taq DNA聚合酶聚合酶17逆转录酶逆转录酶（revers
9、e transcriptase）是依赖是依赖RNA的的DNA聚合酶，它以聚合酶，它以RNA为模板，为模板，4种种dNTP为底为底物，催化合成物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。逆转录酶是多功能酶。RNA指导的指导的DNA聚合酶活性（聚合酶活性（RDDP）核糖核酸酶核糖核酸酶H活性（活性（RNaseH）DNA聚合酶活性（聚合酶活性（DDDP）3）逆转录酶）逆转录酶185 3 3 5 RNA(用用 表示表示)RNA-DNA 杂化分子杂化分子 3 5 RNase （核酸酶核酸酶H活性活性)DDDP （DNA聚合酶活性聚合酶活性）4种种dNTP RDD
10、P （逆转录酶逆转录酶）引物、引物、4种种dNTP 病毒双链病毒双链DNA用用 表示）表示）（cDNA第二链第二链(complementary DNA，cDNA)与病毒与病毒RNA 互补的互补的DNA(用用 表示表示)5 3 3 5 5 3 5 3 19末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称末端转移酶）：，简称末端转移酶）：分子量为分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链移到单链或双链DNA分子的分子的3 末端末端-OH上。上。末
11、端转移酶的功能主要有：末端转移酶的功能主要有：在载体或目的基因在载体或目的基因 3 末端加上互补的同质多聚尾，形末端加上互补的同质多聚尾，形成成人工粘性末端人工粘性末端，便于，便于DNA重组连接。重组连接。用于用于DNA 3 末端的同位素探针标记。末端的同位素探针标记。4）末端脱氧核苷酰转移酶）末端脱氧核苷酰转移酶20(A、G、C、T)n nOH5 5 335 5 33OH5 5 3 3 5 5 33(A、G、C、T)n n Mg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5 5 33OH5 5 33OH 5 5 335 5 33(A、G、C、T)n n Co2+dNTPnppiCo2+dNT
12、Pnppi（1）底物是）底物是单链单链DNA或有或有3 突出末端突出末端的双链的双链DNA，需要，需要Mg2+。（2）底物是）底物是平端平端或或3 凹端凹端的双链的双链DNA，需要，需要Co2+。(A、G、C、T)n n21DNA连接酶连接酶（DNA ligase）：称为基因工程的缝：称为基因工程的缝纫针，它的主要功能是纫针，它的主要功能是催化两个互补粘性末端催化两个互补粘性末端或平末端双链或平末端双链DNADNA分子的分子的5 5 磷酸基团与磷酸基团与3 3 羟基羟基形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末，将具有相同粘性末端或平末端的端的DNADNA连接起来。连接起来。DNA
13、连接酶包括连接酶包括大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶和和T4DNA连接酶连接酶两种类型。两种类型。3、DNA连接酶连接酶2223碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除的作用是催化去除DNA、RNA或或dNTP上的上的 5-磷酸基团磷酸基团。主要用途有：。主要用途有：除去除去DNA片段上的片段上的5 磷酸以防自身连接。磷酸以防自身连接。在使用在使用T4多核苷酸激酶和多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从同位素标记前，从RNA或或DNA上除去上除去5 端的端的磷酸。磷酸。4、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶 5-pCpGpC -OH 3 碱性磷酸酶碱性磷酸酶5-Cp
14、GpC -OH 3 5-p3-HO5-HO3-HO245、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 5-CpGpC -OH 3p+ADP+ATP5-CpGpC -OH 3T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶前向反应前向反应：交换反应交换反应：5-CpGpC -OH 3+ADP -32P dATP 二硫苏糖醇二硫苏糖醇,Mg2+过量过量ADPT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶p*+ATP25核酸酶核酸酶S1可水解双链可水解双链DNA、RNA或或DNA-RNA杂交分杂交分子中的子中的单链部分单链部分。其主要作用有：。其主要作用有：除去粘性末端以产生除去粘性末端以产生平末端平末端。除去除去cDNA合成时形成的合成时形成的发夹
15、结构发夹结构。分析分析RNA的的茎环结构茎环结构和和DNA-RNA分子的分子的杂交杂交情况。情况。6、核酸酶、核酸酶S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1+264.2 载体载体载体载体（vector）：指能携带外源）：指能携带外源DNA片段导入宿片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。制备的目的基因或制备的目的基因或DNA片段必须与合适的载体连接形片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质常用的载体有
16、：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。粒和病毒等。271、克隆载体、克隆载体克隆载体克隆载体：能将载体外源能将载体外源DNA在受体细胞中复在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的制、扩增并产生足够量目的DNA的载体。的载体。28能能自我复制自我复制并具较高的拷贝数。并具较高的拷贝数。分子量一般分子量一般 10Kb。带有带有遗传筛选遗传筛选标记。标记。有适当的有适当的限制酶酶切位点限制酶酶切位点，便于外源，便于外源DNA的插的插入和筛选。入和筛选。v多克隆位点多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）：）：载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点。载体上具有的多个限制酶的单一
17、酶切位点。克隆载体应具备的特征克隆载体应具备的特征291）质粒克隆载体）质粒克隆载体质粒克隆载体的主要用途：质粒克隆载体的主要用途：用于保存和扩增用于保存和扩增 2Kb目的目的DNA。构建构建cDNA文库。文库。目的目的DNA的测序。的测序。作为核酸杂交时的探针来源。作为核酸杂交时的探针来源。30pBR322质粒克隆载体质粒克隆载体pBR322质粒是由一系列质粒是由一系列大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNA通过通过DNA重重组技术构建而成的双链克隆载体，长为。组技术构建而成的双链克隆载体，长为。它含有一个能保证高拷贝自我复制的它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点复制起始点（Ori），并装有），
18、并装有四环素抗性（四环素抗性（Tetr）基因）基因和和氨苄青霉素氨苄青霉素抗性（抗性（Ampr）基因）基因供菌落筛选。供菌落筛选。在这两个抗性基因中分别含有在这两个抗性基因中分别含有BamH I和和Pst I等限制酶等限制酶的的单一酶切位点单一酶切位点，用于插入外源，用于插入外源DNA片段。如有外源片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。31 复制复制起始点起始点抗药基因抗药基因抗药基因抗药基因pBR322载体载体32pUC系列载体系列载体 pUC系列载体是由系列载体是由pBR322质粒和质粒和M13噬菌体重组构建噬菌体重组构建而成的而成的
19、双链双链DNA质粒质粒载体。载体。pUC18和和pUC19质粒长约，除多克隆位点互为相反方向质粒长约，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。排列外，其它序列均相同。pUC质粒含质粒含Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的自大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ 基因基因，该基因序列中含，该基因序列中含有有多克隆位点多克隆位点。33pUC18载体载体342）噬菌体克隆载体）噬菌体克隆载体噬菌体噬菌体（bacteriophage，phage）：指感染细菌的病毒。：指感染细菌的病毒。按其生活周期分为两种类型：按其生活周期分为两种类型：1.溶菌性
20、噬菌体：溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。2.溶原性噬菌体：溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。35野生型的野生型的 噬菌体是线性双链噬菌体是线性双链DNA，全长约，其中，全长约，其中60%（约（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间）是溶菌生长所必需，中间40%的区域的区域为非必需，为非必需，可被外源可被外源DNA片段代替而不影响片段代替而
21、不影响 噬菌体的噬菌体的生存。生存。噬菌体噬菌体5 末端含末端含12核苷酸的互补单链顺序，是天然的核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为粘性末端，称为cos位点位点，噬菌体感染宿主菌后，其粘噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状端通过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。分子。噬菌体载体噬菌体载体36 噬菌体载体的结构噬菌体载体的结构 37 噬菌体载体的特点噬菌体载体的特点重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的75%105%之间。之间。筛选标记：筛选标记：l外源基因插入型：蓝白斑外源基因插入型：蓝白斑(LacZ)筛选。筛选。l外源基因置
22、换型：噬菌斑数目（转染率高外源基因置换型：噬菌斑数目（转染率高100 1000倍）。倍）。38 噬菌体载体的用途噬菌体载体的用途 用作一般的克隆载体。用作一般的克隆载体。用于构建基因组或用于构建基因组或cDNA文库（文库（22Kb）。）。用于抗体库或随机肽库的构建。用于抗体库或随机肽库的构建。核酸的序列分析。核酸的序列分析。39M13噬菌体噬菌体野生型野生型M13M13噬菌体为噬菌体为左右的闭环正链左右的闭环正链DNADNA分子。克隆的分子。克隆的外源基因片段外源基因片段1kb1kb1kb1kb。M13M13噬菌体能以噬菌体能以单链和双链单链和双链两种方式存在，可用两种方式存在，可用于于感染感
23、染(经包装的单链经包装的单链DNA)DNA)和转化和转化(双链双链DNA)DNA)。M13M13中引入的多克隆位点，正好插入中引入的多克隆位点，正好插入LacZLacZ基因内，可利基因内，可利用用蓝白色噬菌斑蓝白色噬菌斑筛选重组体。筛选重组体。M13M13噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主细胞（细胞（呈呈溶源状态生长溶源状态生长，故可从细菌培养液中获得噬故可从细菌培养液中获得噬菌体，制备单链菌体，制备单链DNADNA）。）。40M13噬菌体噬菌体在细菌内的复制模式图在细菌内的复制模式图噬菌体噬菌体正链正链复制复制复制型复制型DNA经经pII
24、pII蛋白蛋白造缺口造缺口355335滚环复制滚环复制释出单链释出单链DNADNA(正链正链)经经pIIpII蛋白蛋白剪切剪切进入下进入下一循环一循环41粘粒粘粒(cosmid)是由质粒和是由质粒和 噬菌体的噬菌体的cos位点构位点构建而成。建而成。粘粒载体组成：粘粒载体组成：粘粒载体组成：粘粒载体组成：质粒复制的质粒复制的起始位点起始位点(Ori)。携带携带抗药抗药基因。基因。用于插入目的基因的用于插入目的基因的单一酶切单一酶切位点。位点。噬菌体的噬菌体的cos位点。位点。3）粘粒克隆载体）粘粒克隆载体42粘粒载体的粘粒载体的特点特点粘粒载体大小为粘粒载体大小为46Kb，而，而插入外源基因长
25、达插入外源基因长达4050kb。加入加入 噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成成类似于类似于 噬菌体的具感染能力的颗粒噬菌体的具感染能力的颗粒，容易，容易进入大肠杆菌。进入大肠杆菌。粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。表现质粒的特性。43粘粒载体的粘粒载体的用途用途 克隆大片段克隆大片段DNA。构建基因组文库。构建基因组文库。442、表达载体、表达载体表达载体表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。转录和正确翻译的载体。基因表达、合成有功能的蛋白质
26、依赖于基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的基因的有效转录、有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。正确的翻译和翻译后加工。45报告基因（报告基因（reporter gene）为了判断某一待测为了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采序列的生物活性，常采用报告基因方法。用报告基因方法。报告基因报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来和表达水平来反映上游待测基因功能反映上游待测基因功能的基因，的基因，又称报道基因。又称报道基因。461）原核细胞表达载体）原核细胞表达载体真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基因：真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基
27、因：插入方向的正确性；插入方向的正确性；受原核启动子的控制；受原核启动子的控制；必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。47原核细胞的表达载体主要是原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：表达系统调控元件：启动子启动子核糖体结合位点核糖体结合位点转录终止信号。转录终止信号。48（1）启动子（）启动子（promoter）如乳糖启动子（如乳糖启动子（Lac）、色氨酸
28、启动子（）、色氨酸启动子（Trp）、）、Tac启动子（启动子（Trp-Lac）以及）以及PL和和PR启动子等。启动子等。5 TTGACATATAAT/3-35区区 -10区区 转录起始点转录起始点Pribnow boxDNA原核细胞启动子示意图原核细胞启动子示意图49（2）SD序列序列mRNA50（3）终止子（）终止子（terminator）终止子：终止子：一个基因的一个基因的3 末端有一特定的末端有一特定的DNA序序列，它具有被列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功聚合酶识别并停止转录的功能。能。该序列含有一段富含该序列含有一段富含A/T和富含和富含G/C的的回文对称回文对称结构，终止子
29、转录后形成的结构，终止子转录后形成的RNA具有具有茎环状局茎环状局部二级结构部二级结构。51 -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGC TTTTTTNNN-DNA-NNTT CGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN-G/C富含区富含区2G/C富含区富含区1A/T富含区富含区5 3 5 3 RNA-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH5 3 RNARNA结构结构5 G C NN NN CC GC GC GG CG CA UA U NNNN UUUU-OH 3 DNADNADNADNA转录的强转录的强转录的强转录的强终止子模式图终止子模式图终止子模式图
30、终止子模式图转录转录52非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。如白酶降解。如pKK223-3质粒载体。质粒载体。分泌型表达载体：产生带信号肽的分泌型融合蛋白，分泌型表达载体：产生带信号肽的分泌型融合蛋白，可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确折叠，易提取。如折叠，易提取。如PINlll系列。系列。融合型表达载体：产生由较短的原核细胞多肽和真核融合型表达载体：产生由较短的原核细胞多肽和真核细胞蛋白质构成的融合蛋白，具有抗原性，较天然的细胞蛋白质构成的融合蛋白，具有抗原性，较天然的
31、外源蛋白稳定。如外源蛋白稳定。如pGEX系列。系列。原核细胞表达载体的类型原核细胞表达载体的类型53真核表达载体的真核表达元件有：真核表达载体的真核表达元件有：启动子启动子/增强子增强子终终止位点和加止位点和加poly A信号信号。原核质粒序列原核质粒序列：包括复制起始序列和抗药基因标记。：包括复制起始序列和抗药基因标记。启启动动子子：转转录录起起始始位位点点上上游游2530bp有有富富含含AT的的TATA框框，TATA框框的的上上游游约约100200bp处处为为上上游游启启动动子元件。子元件。增增强强子子（enhancer）：是是一一类类显显著著提提高高基基因因转转录录效效率率的的顺式作用元
32、件。顺式作用元件。终止子和加终止子和加polyA信号（信号（AAUAA）。）。2）哺乳动物细胞表达载体）哺乳动物细胞表达载体541.目的基因的获取目的基因的获取2.载体的选择载体的选择3.目的基因和载体的连接目的基因和载体的连接4.重组重组DNA导入受体细胞导入受体细胞5.重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定4.3 基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤55连接连接含含重组子重组子的的阳性克隆阳性克隆载体载体+目的基因目的基因转化、筛选转化、筛选和和鉴定鉴定阳性克隆阳性克隆DNADNA重组体重组体+受体细胞受体细胞基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤 分、切、接、转、筛分、切、接、转、筛分、切、
33、接、转、筛分、切、接、转、筛56 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取2）逆转录合成）逆转录合成cDNA3）人工合成）人工合成DNA片段片段4）直接从染色体）直接从染色体DNA中分离目的基因中分离目的基因1、目的基因的获取、目的基因的获取571）从基因文库中获取）从基因文库中获取目的基因：目的基因：指被研究的某一基因或指被研究的某一基因或DNA序列，序列，即需要克隆或表达的基因。即需要克隆或表达的基因。基因组文库基因组文库（genomic library，G-文库）文库）是指含是指含有某种生物全部基因随机片段的重组有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆克隆群。群。58用逆转录法得到的目的
34、基因进行克隆，可获得用逆转录法得到的目的基因进行克隆，可获得较完整的连续编码序列较完整的连续编码序列，易在宿主细胞中表达，易在宿主细胞中表达及筛选。及筛选。选用富含目的基因选用富含目的基因mRNA的细胞作为实验材料，的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因。有利于分离到目的基因。如胰岛素基因的如胰岛素基因的mRNA主主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的mRNA占网质红细占网质红细胞总胞总mRNA的的50%90%。2）逆转录合成）逆转录合成cDNA59根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸
35、短序酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。合成仪人工合成目的基因。适用于合成适用于合成分子量较小分子量较小的目的基因的目的基因（100bp以内）以内）。如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。腺素及胰岛素原的基因等。3）人工合成）人工合成DNA片段片段60根据染色体根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。、分离目的基因。适用于制备适用于制备原核生物原核生物目的基因，因为：目的
36、基因，因为：真核细胞染色体真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，它们在原核细有丰富的内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。胞中转录后不能被剪接。真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的目的基因。目的基因。4）直接从染色体）直接从染色体DNA中分离目的基因中分离目的基因61根据外源根据外源DNA的特性和受体细胞的特性选择合的特性和受体细胞的特性选择合适的载体。适的载体。2、载体的选择载体的选择621)1)粘性末端连接粘性末端连接3、目的基因和载体的连接、目的基因和载体的连接本法适用于在质粒和目的本法适用于在质粒和目的基因上有基因上有相同相同单
37、或双单或双酶切酶切位点。位点。63粘性末端粘性末端DNA重组体的构建重组体的构建 3 HO-G CTTAA-p 5 5 p-AATTC G-OH 3 3 HO-G CTTAA-p 5 5 p-AATTC G-OH 3 质粒质粒 目的基因目的基因 目的基因目的基因和载体连接和载体连接 EcoR EcoR 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 3 HO-G CTTAA-OH 5 5 HO-AATTC G-OH 3 退火退火 DNA连接酶连接酶 3 HO-G CTTAA G CTTAA-p 5 5 p AATTC G AATTC G-OH 3 642)2)平末端连接平末端连接质粒和目的基因上没有相同的酶切位点质粒和
38、目的基因上没有相同的酶切位点质粒质粒产生产生平末端平末端的的内切酶内切酶DNA连接酶连接酶目的基因目的基因目的基因目的基因产生产生粘性末粘性末端端的的内切酶内切酶产生产生粘性末粘性末端端的的内切酶内切酶核酸酶核酸酶S1核酸酶核酸酶S165人工接头人工接头本法适用于在本法适用于在质粒和目的基质粒和目的基因上因上没有相同没有相同的酶切位点。的酶切位点。66本法适用于在本法适用于在质粒和目的基质粒和目的基因上因上没有相同没有相同的酶切位点。的酶切位点。通过同聚尾连接通过同聚尾连接67质粒质粒 目的基因目的基因 3 3 3 ACGTC G 5 5 G CTGCA 3 3 GnGGGACGTC G 5
39、5 G CTGCAGGGGn 3 3 CnCCC 5 5 CCCCn 3 末端转移酶末端转移酶 dGTP 末端转移酶末端转移酶 dCTP 混合，退火混合，退火 1）转化细菌）转化细菌2）体内修复）体内修复同聚尾连接法构建同聚尾连接法构建 DNA重组体重组体G CCCC GGGGACGTC CTGCAGGGG CCCC G Pst 核酸外切酶核酸外切酶 目的基因和目的基因和载体连接载体连接GACGT C CTGCA GG ACGTC C TGCAG CCC GGG GGG CCC Pst Pst 684、重组、重组DNA导入受体细胞导入受体细胞常用的受体细胞是常用的受体细胞是大肠杆菌大肠杆菌。转
40、化转化（transformation）：是指）：是指以质粒以质粒DNA或以或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。它为载体构建的重组子导入细菌的过程。感受态细胞感受态细胞(competent cell)：细胞膜结构改变、细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。能力的细胞。69制备感受态细胞的基本方法制备感受态细胞的基本方法CaCl2处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。701 1）重组体的筛选重组体的筛选根据载体的抗药性标志筛选根据载体的抗药性标志
41、筛选 大多数质粒载体带有大多数质粒载体带有抗生素抗性基因抗生素抗性基因（如（如Ampr、Tetr等），等），当带有完整抗性基因的载当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，生素抗性基因而存活并形成菌落，未转化菌不未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。能存活，但应排除未重组的空载体。5、重组体的筛选和鉴定、重组体的筛选和鉴定71根据载体抗药性标志插入失活选择根据载体抗药性标志插入失活选择某些质粒载体如某些质粒载体如 pBR322质粒中有质粒中有Ampr和和Tetr 抗性基因，抗性基因，在这两个基因中装有
42、几个常用的在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源，如将外源DNA片段插入片段插入BamH识别序列时，则此质粒由识别序列时，则此质粒由Tetr变为对变为对四环素敏感（四环素敏感（Tets）。）。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为有空载体，此筛选方法称为双抗生素筛选法双抗生素筛选法。72双抗生素筛选法双抗生素筛选法73
43、-半乳糖苷酶基因失活筛选（半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法蓝白斑筛选法）某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ 基因，基因，该基因含一段编码该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸个氨基酸-肽的肽的DNA片段，片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现半乳糖苷酶实现基因内基因内-互补互补，形成完整的，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示剂底物半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal 形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。形成蓝色产物，结果重组
44、克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入当外源基因插入lacZ 基因中基因中MCS，lac -肽基因阅读肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性，结果重组半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选法蓝白斑筛选法。7475根据插入的外源性基因的性状进行筛选根据插入的外源性基因的性状进行筛选当细胞生物合成途径中某个酶的编码基因失活当细胞生物合成途径中某个酶的编码基因失活后，该细胞成为后，该细胞成为营养缺陷型营养缺陷型，如导入细胞的重，如导入细胞的重组组DNA能弥补缺陷的基因，那么培养基中就不能弥补缺陷的基因，那么培养基中就不需补充有关
45、的营养成分，由此可挑选出含重组需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重组DNA的阳性细菌。的阳性细菌。76核酸杂交技术筛选核酸杂交技术筛选 将转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，应将转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，应用用特异性的核酸探针特异性的核酸探针对其进行原位杂交，可筛对其进行原位杂交，可筛选出阳性克隆。选出阳性克隆。对于噬菌体载体的克隆，此法也可通过噬菌斑对于噬菌体载体的克隆，此法也可通过噬菌斑的原位杂交筛选阳性克隆。的原位杂交筛选阳性克隆。通过斑点杂交和通过斑点杂交和Southern blot杂交技术筛选杂交技术筛选。772）重组体的鉴定）重组体的鉴定根据重组子大小鉴定根据重组子大小
46、鉴定 重组子装有外源重组子装有外源DNA，分子量较原载体大得，分子量较原载体大得多，从挑选的菌落中分别提取重组多，从挑选的菌落中分别提取重组DNA和原和原载体载体DNA，直接进行电泳，直接进行电泳，原载体原载体DNA分子分子量较小、电泳迁移率较大；量较小、电泳迁移率较大；而而重组重组DNA因分因分子量较大而迁移率较小子量较大而迁移率较小。78酶切鉴定酶切鉴定分别提取重组载体分别提取重组载体DNA和原载体和原载体DNA，根据已，根据已知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的内知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，只出现切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，只出现一条
47、区带的是原载体本身，而一条区带的是原载体本身，而重组载体重组载体还多一还多一条条外源外源DNA片段的区带片段的区带，可根据，可根据DNA mark来来分析插入分析插入DNA片段的分子量。片段的分子量。79PCR鉴定鉴定提取重组子提取重组子DNA，利用插入外源基因两端互补，利用插入外源基因两端互补的特异引物，对重组子的特异引物，对重组子DNA进行进行PCR扩增。此扩增。此法不仅可分离扩增目的基因，还可对目的基因法不仅可分离扩增目的基因，还可对目的基因进行测序。进行测序。80DNA序列分析鉴定序列分析鉴定DNA序列分析是确定分离的序列分析是确定分离的DNA是否是特异的是否是特异的外源性插入外源性插
48、入DNA的唯一方法（的唯一方法（金标准金标准），也是），也是最确定的方法。最确定的方法。自动化，快速、简便和实用。自动化，快速、简便和实用。818 核酸分子杂交核酸分子杂交8.1 核酸杂交基本原理核酸杂交基本原理8.2 核酸探针技术核酸探针技术8.3 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术8.4 基因芯片基因芯片82核酸定性或定量检测核酸定性或定量检测基因克隆、突变及其表达研究基因克隆、突变及其表达研究疾病的临床诊断疾病的临床诊断主要用途主要用途838.1 核酸杂交基本原理核酸杂交基本原理核酸变性核酸变性核酸复性核酸复性核酸分子杂交核酸分子杂交848.1.1 核酸变性核酸变性变性变性（denatur
49、ation）：在某些理化因素的作用：在某些理化因素的作用下，维系下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。由双螺旋变成单链过程。化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。的。化学结构变化：化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。其一级结构的改变。8586DNA的变性因素的变性因素凡能破坏双螺旋稳定性的因
50、素都可以成为变性凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。的条件。加热加热极端的极端的pH有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）87变性变性DNA的理化性质的理化性质溶液黏度降低：溶液黏度降低：DNA双螺旋是紧密的双螺旋是紧密的“刚性刚性”结构，结构，变性后代之以变性后代之以“柔软柔软”无规则单股线性结构，无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降。黏度明显下降。溶液旋光性发生改变：变性后溶液旋光性发生改变：变性后DNA分子的对称性及分子的对称性及局部构型改变。局部构型改变。紫外吸收增加紫外吸收增加：DNA变性后，变性后，DNA 溶液的紫外吸收溶液的紫外