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1、结构生物学15 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望免疫系统的分子识别l免疫系统一览l抗体的结构与抗原的识别l主要组织相容性复合物（MHC）的结构与抗原的识别lT细胞受体（TCR）的结构与功能免疫系统一览l免疫性免疫性 是肌体识别和排除外来抗原物质的功能n抗原：抗原：是一类能够诱导肌体产生免疫应答并能与相应抗体或T细胞受体发生特异反应的物质。蛋白质是主要的抗原，糖类、脂类、核酸是半抗原。l肌体的免疫性分两种类型n先天性免疫：先天具备，非特异性，不需要外来
2、抗原的识别n适应性（获得性）免疫：高度特异性，多样性，具有记忆的功能，识别自身和非自身的抗原l先天性免疫的组成n解剖学屏障：皮肤和黏膜n生理屏障：温度、pH、体液或组织中的杀菌物质n吞噬细胞屏障：巨噬细胞和嗜中性粒细胞n发炎屏障：组织损伤引起的炎症反应可以控制损伤l适应性免疫的类型n体液免疫：抗体介导的免疫应答体液免疫：抗体介导的免疫应答 体液免疫中最重要的角色是B淋巴细胞（B细胞），B淋巴细胞在骨髓中成熟和分化，其细胞膜上有表达的抗体分子，抗体分子和特定抗原的相互作用引起B细胞分化成浆细胞，浆细胞表达分泌型的抗体，分泌的抗体结合抗原，使抗原被中和并促进抗原的清除。n细胞免疫：细胞毒性细胞介导
3、的免疫应答细胞免疫：细胞毒性细胞介导的免疫应答 细胞免疫中的关键角色是T淋巴细胞（T细胞）。T细胞在骨髓中发生，但迁移到胸腺中成熟。T细胞膜上有表达的抗原结合受体，称为T细胞受体（TCR）。TCR并不直接识别抗原，而是通过称为主主要组织相容性复合物（要组织相容性复合物（MHC）的分子识别抗原。MHC分子位于细胞膜上，有两种类型：I型（在所有有核细胞中表达）和II型（只在抗原递呈细胞APC中表达）。当T细胞遇到结合在细胞表面的MHC分子上的抗原时，便进行增殖和分化。有两种T细胞亚群：T辅助细胞（TH）和T细胞毒性细胞（TC）。当TH通过MHC分子与抗原相互作用时，TH细胞被活化从而分泌一系列细胞
4、因子，这些细胞因子对于激活B细胞、TC细胞、巨噬细胞和其他细胞起重要作用。在细胞因子的影响下，并且在与MHC-抗原复合物结合后，TC细胞增殖并分化成有细胞毒性的T淋巴细胞（CTL），这种细胞具有消灭变异细胞如肿瘤细胞和病毒感染细胞的能力。l免疫应答过程的几个特点n抗原识别的关键分子是抗体、抗原识别的关键分子是抗体、TCR、和、和MHC分子分子n体液和细胞免疫反应的产生依赖于体液和细胞免疫反应的产生依赖于TH细胞的激活。细胞的激活。TH细胞的激活发生在TCR识别APC（可能是B细胞）表面的MHC-抗原复合物时，激活导致TH细胞分泌细胞因子，细胞因子诱导B细胞分化成浆细胞，以及TC细胞分化成CTL
5、细胞，此外还诱导其他不属于适应性免疫的细胞如自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞。nB细胞和细胞和T细胞的专一性在接触抗原之前就决定了。细胞的专一性在接触抗原之前就决定了。这意味着对所有存在的每一种抗原，都有一种对应的抗体和一种T细胞受体TCR，当抗原结合到与它相应的TCR上时（通过MHC分子），导致对这种抗原专一的细胞群的增殖和分化，这一过程称为克隆选克隆选择择。n免疫记忆是淋巴细胞克隆选择的结果免疫记忆是淋巴细胞克隆选择的结果。在克隆选择过程中，一种类型的细胞分化成记忆细胞，这些记忆细胞比一般的淋巴细胞存活时间更长，当第二次接触抗原时，在初次应答初次应答中产生的记忆细胞与抗原发生作用，产生更快、
6、更强烈的应答反应，称为再次应答再次应答。这就是免疫作用的原理。l免疫系统的组成n免疫器官：是淋巴细胞和其他免疫细胞发生、分化、成熟、定居、增殖和产生免疫应答的场所。l中枢免疫器官：骨髓、胸腺，以及腔上囊（禽类）l外周免疫器官：淋巴结、脾、粘膜相关淋巴组织和皮肤相关淋巴组织。n免疫细胞：泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞。l淋巴细胞：T细胞、B细胞、NK细胞l抗原递呈细胞（APC）：单核-吞噬细胞、树突状细胞、B细胞l其它免疫细胞：各种粒细胞、肥大细胞、血小板及红细胞等n免疫分子：l免疫细胞膜分子：T细胞抗原识别受体（TCR）、B细胞抗原识别受体（BCR）、主要组织相容性抗原（MHC）、
7、白细胞分化抗原、粘附分子、促分裂素受体、细胞因子受体、免疫球蛋白FC受体和补体受体等。l可溶性分子：免疫球蛋白分子、补体分子、及各种细胞因子免疫系统的分子识别l免疫系统一览l抗体的结构与抗原的识别l主要组织相容性复合物（MHC）的结构与抗原的识别lT细胞受体（TCR）的结构与功能抗体的结构l抗体和免疫球蛋白（Ig）n抗体是由浆细胞产生的能与抗原发生特异性结合的一类球蛋白n免疫球蛋白是具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白n抗体是生物学和功能上的名称，免疫球蛋白是结构和化学本质上的概念n抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不都具有抗体活性l免疫球蛋白的类型和结构n免疫球蛋白有5种类型：IgG,Ig
8、M,IgA,IgD,IgEn所有Ig的基本单位都是由两条相同的轻链（L链，25kD，有两种类型：l或k）和两条相同的重链（H链，50kD,有5种不同类型：g,m,a,d,e）组成，由这样4条肽链和几对二硫键连接形成的一个基本单位，称为Ig单体。lIg单体的结构nIg的每条链都可以划分成几个结构域，轻链2个，重链4个。每个结构域包含110个氨基酸残基n序列比较表明：N末端结构域序列变化很大，称为可可变区变区（V）；C末端结构域序列变化较小，相对稳定，称为恒定区恒定区（C）。6个结构域记为：VL、VH、CL、CH1、CH2、CH3。n在V区内序列变化不是恒定的，在特殊的区域变化很大，而其他区域则同
9、源性很高。变化很大的这些区域称为超变区超变区。超变区是Ig与特异性抗原的决定族相结合的位置，因而又称互补决定区互补决定区（CDR1 CDR3）。不同Ig之间这些区域的大小和序列都不同。n铰链区铰链区：在Ig重链CH1和CH2之间有一段较长的肽链，称为铰链区（hinge region）。铰链区内的肽链易于弯曲，有相当的柔性，是酶解的敏感部位。nIg分子酶解碎片分子酶解碎片抗体的多样性是怎样获得的？l对于几乎任何抗原，免疫系统都能产生一个抗体，其结合位点的多样性几乎不受限制，这一点是如何达到的呢？l两种假说n体细胞重组假说：相对少的基因片段重组产生可变区。n体细胞突变假说：B细胞分化过程中具有很高
10、的突变率。l这两种机制对抗体的多样性都有贡献Ig可变区是由不同基因片段重组连接而成l重链V区是由3个基因片段组成：V,D,和 J。l轻链V区是由2个基因片段组成：V 和 Jl基因片断数目及其组合：n重链：1000VH,10DH,6JH,60,000个VDJ组合;n轻链：150VK,5JK,750个VJ组合n由于接头处连接方式的不够明确，导致更大的多样性，组合数可增大10倍：(60,000 x10)x(750 x10)=4.5x109lCDR1和CDR2是由V基因片段内部编码的lCDR3来自于V-J或V-D-J的接头处，对于轻链还加上 J 的N末端部分，对于重链还加上 D 和 J 的N末端部分轻
11、链基因的形成和表达重链基因的形成和表达体细胞突变是抗体多样性的又一个来源l在基因片断连接过程中可以插入或删除一些核苷酸lIg基因的突变率比其他基因高1百万倍，这些突变是在B细胞中特殊的酶的促使下发生的l突变多数发生在CDR区l在二次或三次免疫后，突变更加频繁完整Ig的晶体结构l由于铰链区的柔性通常会阻碍结晶，所以完整Ig的晶体结构相对较少l铰链区的柔性对于抗原的识别是必要的IgG分子有一定的自由度l铰链区是柔性的l可变结构域与不变结构域之间的区域，称为开关肽。由于开关肽构象的柔性，可变结构域和不变结构域的取向可以不同。取向由肘角（两个局部二重轴之间的夹角，127 227）定义。Ig片段的晶体结
12、构lIg是糖蛋白，聚糖链连接在重链的C区V区和C区都具有希腊钥匙b桶折叠lV区和C区结构域没有序列相似性，但折叠模式却很相似lC区结构域有7条b折叠链，其中4条形成一个b片层，另外3条形成第二个b片层，b片层之间由二硫键连接在一起，整个结构是一个希腊钥匙b桶，b链之间的环区很短。lV区结构域很相似但是有9条b链，两条额外的b链处于第3和第4条链之间，包含了CDR2。位于b桶一侧的b链之间的环区更长，包含了超变区（CDRs）。超变区位于V区结构域的环上l轻链和重链的V区结构域的结构非常相似。l在重链和轻链的共6个CDRs中，5个CDR的构象变化很有限（因为它们也需要与b片层框架相互作用），但是重
13、链的CDR3的构象变化相当大。结构域的相互作用lVL和VH、CL和CH1相互接触，这些结构域的结合非常紧密和广泛。lC区结构域的结合主要通过两个4条链的b片层之间的相互作用，b片层中有很多疏水残基彼此相互作用。lV区结构域的相互作用则很不同。为了让CDRs靠近，5条链的b片层形成了结构域相互作用的表面，结构的堆积不象C区结构域那样紧密。抗原结合位点l来自重链和轻链的6个CDR环区相互靠近，形成抗原结合位点，并在b桶的顶部展开。lCDRs要么形成一个可以结合半抗原的裂缝，要么形成一个可以结合蛋白质的平坦的表面。通过改变CDRs的大小和氨基酸组成，抗原结合位点可以具有不同的形状和电荷。抗原结合位点
14、中CDR的排列lCDR3总是处在中心，CDR1和CDR2总是处在边上半抗原的结合l半抗原是附着在蛋白质上的小分子，能够诱导肌体产生抗体。l右图是Fab-磷酸胆碱复合物的结构。磷酸胆碱埋藏在由所有CDR环（轻链CDR2除外）形成的裂缝中，结合模式与通常的底物或抑制剂的结合非常相似，抗原-抗体界面在形状和电荷上是高度互补的。与蛋白质的相互作用：抗体-溶菌酶复合物l溶菌酶与蛋白质的相互作用涉及到一个大的面积（20 x302），总的埋藏表面积大约7002，75110个原子对参与，1023个氢键，3个盐键。l在抗原和抗体中带有突起和凹陷的不规则表面无论在形状还是化学上都构成互补。水分子很大程度上被排除在
15、表面之外，结合的水分子都参与形成氢键网络。l来自抗体的17个残基与溶菌酶的残基发生接触，原子堆积象蛋白质内部一样紧密，表面的互补性有少量不理想。l与抗体接触的溶菌酶的表面是由多肽链中两个不同区域的残基形成：因此三维折叠对于识别是必需的。抗体中几乎所有的CDRs都参与结合。l在抗体结合时溶菌酶分子几乎没有任何构象改变，在抗体分子中也只有很小的变化，结构域之间的取向角度有轻微的改变。这些小的改变有利于抗原-抗体更好的结合。与流感病毒神经氨酸苷酶结合的抗体可变区与流感病毒神经氨酸苷酶结合的抗体可变区蛋白质抗原与半抗原的结合位点比较抗原结合时的构象改变lCDRs是否适应了抗原的结构（诱导契合）还是有预
16、先存在的结合位点（锁钥模型）？关于这个问题的讨论一直在持续。l对溶菌酶和神经氨酸苷酶与抗体的作用来说，是预先存在的结合位点，伴随着多肽主链有12的小的改变和一些大的侧链移动。l但是也有一些抗体（如BV04,anti-DNA,17/9,anti-peptide）发生大的构象改变。例如在17/9中重链CDR3在复合物中有完全不同的构象；在BV04中，抗原-抗体结合后CDR1（轻链）和CDR3（重链）都有一个很不同的构象。l因此，诱导契合和锁钥模型都可能发生，目前诱导契合是占优势的理论。Fab 17/0与多肽抗原免疫球蛋白超家族（IgSF）l免疫球蛋白折叠子是很多不同蛋白的共同模体，这些蛋白质属于免
17、疫球蛋白超家族（IgSF）。l所有这些蛋白质具有一个共同的结构，称为免疫球蛋白同源单位，长度约100氨基酸，中心有能稳定两个b片层的二硫键。l这类蛋白质的成员包括免疫学上重要的分子、细胞识别中重要的蛋白质等，从昆虫到哺乳动物都有出现。免疫球蛋白与疾病lIg与变态反应疾病lIg与浆细胞疾病lIg与免疫缺陷疾病免疫系统的分子识别l免疫系统一览l抗体的结构与抗原的识别l主要组织相容性复合物（MHC）的结构与抗原的识别lT细胞受体（TCR）的结构与功能主要组织相容性复合物（MHC）l主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）是表达于脊推动物有核细胞
18、表面的一类膜蛋白。MHC最初是在研究组织移植的排斥现象时发现的，与肌体识别移植物是自身或非自身的组织有关。进一步的研究表明MHC在抗原递呈和免疫应答调控方面具有重要功能。lMHC分子是IgSF的特殊成员，具有与Ig恒定区相似的结构域。MHC的两个主要类型 I型 II型出现在几乎每个细胞 出现在B细胞用于识别自身和非自身 用于识别免疫细胞杂合二聚体（a链+b2m）杂合二聚体（a链+b链）糖基化的 糖基化的结合短肽（810残基）结合更长的肽（长度可变）MHC的多态性lMHC蛋白是高度多态性的l人I型MHC由3个分离但同源的基因编码：HLA-A,HLA-B,HLA-C（Human Leucocyte
19、 Associated antigen），II型MHC也有3个蛋白l已知在高等脊椎动物中这些基因是多态性最高的，如小鼠的每个MHC基因位点有50个已知的等位基因l因此两个不相干的个体不可能有相同的MHC基因组合（这在器官移植中引起了问题）l但是每个个体只有有限数量的MHC分子。这少数几个分子如何与数量众多的外来抗原发生作用呢？MHC的结构lMHC I型和II型的结构是非常相似的：一个平台式的结构包括一个平坦的8链反平行b片层和位于其上的2个长而轻微弯曲的a螺旋。螺旋之间的空间是抗原性多肽的结合位置。另一个结构域具有典型的免疫球蛋白恒定区的结构MHC蛋白与多肽的结合l外来抗原作为一个整体不能被M
20、HC识别，但是它们可以在细胞内被处理成短肽，后者可以被MHC识别呈递。I型MHC：810残基的短肽主要结合在两个末端。更长的肽（10残基）会在中间突起以保持末端在同样的位置。多肽通常是伸展的构象，一般不依赖于序列，严格偏爱第2、5和C末端的残基。II型MHC：结合长度可变的更长的多肽。多肽从结合位点伸出，没有口袋用来固定多肽的末端。多肽呈多聚ProII构象，对5个位置上的残基有些偏爱。比较两种结合模式l两种情况下都有小的口袋用来结合侧链并与多肽主链原子形成氢键lI型识别多肽末端，是牢固的结合；II型不识别，是松散的结合免疫系统的分子识别l免疫系统一览l抗体的结构与抗原的识别l主要组织相容性复合
21、物（MHC）的结构与抗原的识别lT细胞受体（TCR）的结构与功能T细胞受体（TCR）lT细胞受体是二聚体（a/b,或g/d）,有一个抗原识别位点。与Ig一样，在TCR中发现了4个超变区，其中3个与Ig中的CDRs相似。TCRs也具有可变的和恒定的结构域，对V区和C区结构域，TCR和Ig之间有高度的序列同源性（30%70%）：提示了典型的Ig折叠，a链和b链之间的配对类似于Ig中H链和L链。l编码a/b或g/d链的基因的排列与Ig基因非常相似，由于基因的重排，可以产生巨大数量的蛋白质序列。l与CD3的g,d,e,z组分一起，TCR识别MHC分子呈递的抗原性多肽。CD3是不可变的，它参与信号传导。
22、TCR是如何识别MHC的？lTCR识别嵌入在MHC分子中的多肽：这对其抗原识别位点有限制lCDR1和CDR2的有限的多样性：识别MHC？CDR3的多样性：多肽特异性？l提出的结合MHC-多肽复合物的模型就是基于这种推测，TCR平行于MHC的螺旋，CDR3平行于结合肽单独的TCR的结构la/b链的结构与抗体的Fab碎片相似。3个结构域Va,Vb,Cb类似于Ig折叠。TCR的长度比Fab稍微缩短，中间的肘角区更宽。有一个结构域Ca与Fab非常不同。Ca的结构lCa与Ig的序列差异最大（只有12%18%同源性）l因为具有二硫键的残基模式，大体上呈Ig折叠，但很多结构上重要的其他残基缺失。Ca较小（5
23、0个残基，Ig的C结构域有60/65个残基）l后片层（a,b,c,d）非常象Ig 的后片层，其他片层（e,f,g）则很不同：堆积松散，b链分离得太远，b链之间 的环区更短，f链甚至含有 一个很小的螺旋。识别位点的结构lVa和Vb之间的埋藏界面很小（11602,一般是14202），与Fab一样，经历诱导契合过程l除了CDR2外，其他CDRs的空间结构与Ig的CDRs相似。lTCR家族中很多相互作用的残基是保守的l整体的结合表面是平坦的，但是在Va和Vb的CDR3之间有一个疏水的口袋。（对于识别蛋白质的抗体来说，平坦是特征性的，表面既不特别疏水也不特别亲水）lCDR的顶端是很多小残基（Ala或很多
24、Gly）：这可能有利于更靠近MHCTCR与I型MHC-多肽的复合物A：TCR的MHC-多肽识别位点B：TCR与I型MHC-多肽复合物相互作用的透视图C：I型MHC-多肽复合物D：TCR与MHC-多肽的识别结合TCR与I型MHC的作用方式与推测不同推测的识别方式：CDR1和CDR2与MHC作用，CDR3与多肽作用平行的排列实际的识别方式：Va的CDR1,2,3和Vb的CDR3与MHC接触 CDR3a,CDR3b,CDR1a与多肽接触对角线的排列TCR与II型MHC-多肽的复合物lTCR在MHC分子上有一个更垂直的取向l界面的大小相似，但互补性更好l无论对于整个结合界面还是多肽的识别，Va都起了占优势的作用。（结合界面：Va 5192,Vb 3382 多肽识别：Va 23个接触，Vb 4个接触）l虽然II型MHC比I型MHC结合更长的多肽，但是只有一部分残基被TCR识别，暴露的位于中心的残基特别重要。l在免疫识别过程中，易变的CDR3环区夹住了多肽的中心区域。