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1、细菌的接种、分离与鉴定思路细菌的接种、分离与鉴定思路邵阳市第一人民医院检验科邵阳市第一人民医院检验科罗甫花罗甫花常用细菌培养方法常用细菌培养方法需氧培养法需氧培养法（一般培养）一般培养）适用于需氧菌和兼性厌氧菌培养。适用于需氧菌和兼性厌氧菌培养。培养温度：培养温度：37（采用恒温培养箱）。（采用恒温培养箱）。培养时间：培养时间：1824h。二氧化碳培养法二氧化碳培养法适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌培养。适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌培养。可采用烛缸法、二氧化碳培养箱。可采用烛缸法、二氧化碳培养箱。微需氧培养法微需氧培养法 适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌培养。适用于空肠弯曲菌、幽门螺
2、杆菌等微需氧菌培养。可采用抽气换气法。可采用抽气换气法。厌氧培养法厌氧培养法 适用于专性厌氧菌培养。适用于专性厌氧菌培养。厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等。盐法等。细菌接种的基本程序细菌接种的基本程序 灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本接种接种灭菌接种环灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境带菌接种环的正确烧法热导法热导法：从环的根部（靠近柄部）开始烧，通过热传导让：从环的根部（靠近柄部）开始烧，通过热传导让接种环
3、或针上带的菌慢慢受热，直至干燥，最后放在氧化接种环或针上带的菌慢慢受热，直至干燥，最后放在氧化焰（外层温度高）上彻底灭菌。焰（外层温度高）上彻底灭菌。从还原焰开始法：（从还原焰开始法：（内层温度低），带菌的接种环或针直内层温度低），带菌的接种环或针直接置于此不会引起气溶胶喷溅，待完全干燥后再移至氧化接置于此不会引起气溶胶喷溅，待完全干燥后再移至氧化焰部位彻底灭菌。焰部位彻底灭菌。接种方法接种方法平板划线法平板划线法 原则和目的：通过划线稀释细菌原则和目的：通过划线稀释细菌 获得单个菌落获得单个菌落要领：G G 划线均匀而细密，不重复。划线均匀而细密，不重复。A A 充分的利用培养基的面积。充分
4、的利用培养基的面积。B B 培养基不能划破。培养基不能划破。GBGB 培养时培养皿倒置。培养时培养皿倒置。培养时培养皿倒置的原因培养时培养皿倒置的原因 一一 防止培养基的水分蒸发防止培养基的水分蒸发 二二 防止形成的冷凝水滴落在培养基上造成染菌防止形成的冷凝水滴落在培养基上造成染菌 三三 倒放可以在某种程度上防止菌落蔓延，好形倒放可以在某种程度上防止菌落蔓延，好形成单个菌落，利于计数成单个菌落，利于计数 四四 防止外来的污染防止外来的污染 平板划线法平板划线法（1）连续划线法）连续划线法 此法多用于含菌量相对少，无菌部位此法多用于含菌量相对少，无菌部位来源的如血液，胸腹水，脑脊液等标本的来源的
5、如血液，胸腹水，脑脊液等标本的细菌分离培养。细菌分离培养。（2）分区划线法）分区划线法（可分二区，三区和四区）（可分二区，三区和四区）此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁等标本的细菌的分离培养。等标本的细菌的分离培养。第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环（3）密集划线法）密集划线法 此法用于纸片药敏实验培养此法用于纸片药敏实验培养用于药敏实验细菌在固体培养基中生长表现：细菌在固体培养基中生长表现：1 1、大小、大小、大小、大小 （mmmm表示。表示。表示。表示。1mm1mm以内露滴状
6、；以内露滴状；以内露滴状；以内露滴状；1-2mm1-2mm小小小小菌落。菌落。菌落。菌落。2-4mm2-4mm中等大菌落；中等大菌落；中等大菌落；中等大菌落；4-6mm4-6mm以上称大菌落或巨以上称大菌落或巨以上称大菌落或巨以上称大菌落或巨大菌落）大菌落）大菌落）大菌落）2 2、形状、形状、形状、形状 （圆形、不规则形）（圆形、不规则形）（圆形、不规则形）（圆形、不规则形）3 3、边缘、边缘、边缘、边缘 （整齐、锯齿状）（整齐、锯齿状）（整齐、锯齿状）（整齐、锯齿状）4 4、表面性状（光滑、粗糙、）、表面性状（光滑、粗糙、）、表面性状（光滑、粗糙、）、表面性状（光滑、粗糙、）5 5、隆起度（
7、扁平、隆起、中凸）、隆起度（扁平、隆起、中凸）、隆起度（扁平、隆起、中凸）、隆起度（扁平、隆起、中凸）6 6、颜色及透明度（黄色、灰白、光泽、透明）、颜色及透明度（黄色、灰白、光泽、透明）、颜色及透明度（黄色、灰白、光泽、透明）、颜色及透明度（黄色、灰白、光泽、透明）7 7、硬度（干燥、湿润、粘液）、硬度（干燥、湿润、粘液）、硬度（干燥、湿润、粘液）、硬度（干燥、湿润、粘液）8 8、溶血（在血培养基上的表现）、溶血（在血培养基上的表现）、溶血（在血培养基上的表现）、溶血（在血培养基上的表现）试管培养基接种法试管培养基接种法琼脂斜面接种法琼脂斜面接种法 该法主要用于纯种增菌及保存菌种，也可用该法
8、主要用于纯种增菌及保存菌种，也可用于某些生化鉴定试验如双糖铁培养基的接种。于某些生化鉴定试验如双糖铁培养基的接种。斜面斜面培养培养基基手执塑料杆手执塑料杆手执塑料杆手执塑料杆处处小指夹棉塞小指夹棉塞小指夹棉塞小指夹棉塞试管口离火焰试管口离火焰1cm手执试管底露出斜面手执试管底露出斜面操作顺序：操作顺序：接种环灭菌接种环灭菌 勾取细菌勾取细菌 取棉塞取棉塞 接种接种 塞棉塞塞棉塞 接种环灭菌接种环灭菌 标记标记 培养。培养。细菌分离培养细菌分离培养 选择适合细菌生长的条件和温度选择适合细菌生长的条件和温度 按按无菌操作无菌操作 选择适合细菌生长的培养基选择适合细菌生长的培养基 接种量少接种量少革
9、兰氏染色法步骤革兰氏染色法步骤一般包括初染、媒染、脱色、复染一般包括初染、媒染、脱色、复染1）涂片干后加热固定。）涂片干后加热固定。2）结晶紫染）结晶紫染30s，水洗，水洗3）加碘液约）加碘液约30s，水洗，水洗 4）加加95%酒精数滴，摇动脱色，酒精数滴，摇动脱色，30秒秒-1分钟，至无紫色脱落为止，水洗分钟，至无紫色脱落为止，水洗 5）加复红染色染，染）加复红染色染，染30秒后，水洗。秒后，水洗。干燥，镜检。干燥，镜检。+C鉴定思路鉴定思路乳糖-触酶触酶+微球菌科微球菌科O/FO/F试验氧化型试验氧化型微球菌属微球菌属h2o2h2o2+触酶触酶-链球菌科链球菌科血浆凝固酶血浆凝固酶-新生霉
10、素敏感试验新生霉素敏感试验S表皮表皮葡萄球菌O/F试验发酵型葡萄球菌属血浆凝固酶血浆凝固酶+金黄色金黄色葡萄球菌新生霉素敏感试验新生霉素敏感试验R腐生腐生葡萄球菌MacMac生长试验阳性生长试验阳性肠链球菌属肠链球菌属靛基质靛基质-MacMac生长试验阴性生长试验阴性溶血溶血OptochinOptochinS S为肺链为肺链R R为甲链为甲链溶血溶血杆菌肽杆菌肽S S为为A A群链群链CAMPCAMP试验试验+为为B B群链群链-b鉴定思路鉴定思路乳糖-OX+双糖双糖-非发酵菌科非发酵菌科鞭毛染色鞭毛染色-为为黄杆菌属莫拉黄杆菌属莫拉菌属菌属h2o2h2o2+OX 双糖双糖+肠杆菌科肠杆菌科端
11、鞭毛为假单胞端鞭毛为假单胞一根鞭毛为绿脓一根鞭毛为绿脓周鞭毛为产碱杆菌周鞭毛为产碱杆菌动力动力-NIT-NIT-不动杆菌不动杆菌动力动力+NIT+嗜麦牙单胞菌嗜麦牙单胞菌IMVCIMVC+-+-为大肠为大肠-+-+为产气和肺克为产气和肺克-+-+-+为沙门为沙门D+-D+-为志贺为志贺PD葡萄糖酸盐葡萄糖酸盐Ox-双糖双糖-非发酵菌科非发酵菌科Ox+双糖发酵型双糖发酵型弧菌科弧菌科0/129R为气单胞菌为气单胞菌S为弧菌属和霍乱弧菌为弧菌属和霍乱弧菌实验安排：实验安排：每人一个营养琼脂平皿做划线分离，要求分出每人一个营养琼脂平皿做划线分离，要求分出单个菌落。（培养时倒置）单个菌落。（培养时倒置）每人一支营养琼脂斜面做斜面接种。每人一支营养琼脂斜面做斜面接种。