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1、 生物化学实验生物化学实验Biochemical Experiment 生物化学实验技术理论生物化学实验技术理论一、层析技术l19031903年，俄国科学家首创了一种从绿叶中分离多种不同年，俄国科学家首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。l8080多年来，层析法不断发展，形式多种多样。多年来，层析法不断发展，形式多种多样。5050年代开年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、始，相继出现
2、了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。亲和层析、吸附层析等。l几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。在生化领域内得到了广泛的应用。一、层析技术l1、层析技术原理、层析技术原理l2、层析技术分类、层析技术分类l3、常用层析技术原理、常用层析技术原理 1、层析技术原理l层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为以不同程度分布在两相中，其中
3、一相为固定固定相相，另一相流过此相称作另一相流过此相称作流动相流动相，并使各组分以不并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。同速度移动，从而达到分离的目的。l可分离物质：可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。2、层析技术分类、层析技术分类名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据分配层析分配层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力吸附层析吸附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体
4、气体吸附力吸附力亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小3、常用的层析原理、常用的层析原理l l（1）分配层析）分配层析纸层析纸层析l l原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（配系数（）。）。l l l l 固定相内溶质的浓度固定相内溶质的浓度固定相内溶质的浓度固定相内溶质的浓度 =流动相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度流动相内溶
5、质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水固定相：滤纸上吸附的水固定相：滤纸上吸附的水固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）流动相：有机溶剂（正丁醇）流动相：有机溶剂（正丁醇）流动相：有机溶剂（正丁醇）128646464643232646432321616484848481616 8 8323248483232 8 8 4 4202040404040 2020 4 4 2 2121230304040 3030 1212 2 2纸层析纸层析l l纸层析是最简单的液一液相分配层析。纸层析是最简单的液一液相分配层析。纸层析是最简单的液一液相分配层析。纸层析是最简单的液一液相分配层析。l l滤纸是纸
6、层析的支持物。当支持物被水饱和时，滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。溶的有机溶剂为层析的流动相。溶的有机溶剂为层析的流动相。溶的有机溶剂为层析的
7、流动相。l l对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，温度条件下，温度条件下，温度条件下，R R R Rf f f f是个常数。是个常数。是个常数。是个常数。（2）离子交换层析）离子交换层析l l原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。惰性基质上，从而分离介质中的组
8、分。惰性基质上，从而分离介质中的组分。惰性基质上，从而分离介质中的组分。l l常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）二乙烯苯）二乙烯苯）二乙烯苯）l l阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l l阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三
9、乙基胺乙基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l l可交换离子：阳离子：可交换离子：阳离子：可交换离子：阳离子：可交换离子：阳离子：NaNaNaNa+、H H H H+阴离子：阴离子：阴离子：阴离子：ClClClCl-、OHOHOHOH-示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）电离基团（磺酸根）电离基团（磺酸根）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子可交换离子（钠离子可交换离子（钠离子可交换离子（钠离子）交换离子交换离子交换离子交换离子不
10、交换离子不交换离子不交换离子不交换离子示意图示意图水分水分水分水分子子子子B B物物物物质质质质A A物物物物质质质质（3）吸附层析）吸附层析l l原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。离开，此为吸附现象。离开，此为吸
11、附现象。离开，此为吸附现象。l l吸附现象形成的原因：吸附现象形成的原因：吸附现象形成的原因：吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，吸附作用可能由几种作用力形成，吸附作用可能由几种作用力形成，吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力电引力电引力电引力(形成离子键形成离子键形成离子键形成离子键)、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。l l在不
12、同条件在不同条件在不同条件在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用种力同时起作用种力同时起作用种力同时起作用l l吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。滑石、陶土、粘土。滑石、陶土、粘土。滑石、陶土、粘土。吸附层析示意图吸附层析示意图 吸附剂吸附剂吸附剂吸附剂易吸附
13、分子易吸附分子易吸附分子易吸附分子不易吸附分子不易吸附分子不易吸附分子不易吸附分子（4）亲和层析）亲和层析l l原理：原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。l l专一亲和力分子对：专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、酶与底物、特异性抗原与抗体、酶与底物、特异性抗原与抗体、酶与底物、特异性抗原与抗体、DNADNA和和和和RNARNA、激素和其受体、激素和其受体、激素和其受体、激素和其受体l l载体：载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维使亲和物
14、固相化的水不溶性化合物。如：纤维使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。多孔玻璃。多孔玻璃。多孔玻璃。（5）凝胶过滤）凝胶过滤l l原理：原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。速度不同。速度不同。速度不同
15、。l l物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向垂直向下移动和无定向垂直向下移动和无定向垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗
16、粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。l l凝胶物质：凝胶物质：凝胶物质：凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。电电 泳泳 技技 术术一一一一.电泳的概念电泳的概念电泳的概念电泳的概念二二二二.电泳技术分类电泳技术分类电泳技术分类电泳技术分类三三三三.电泳技术基本原理电泳技术基本原
17、理电泳技术基本原理电泳技术基本原理四四四四.几种常见电泳方法的比较几种常见电泳方法的比较几种常见电泳方法的比较几种常见电泳方法的比较五五五五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理 一一.电泳的概念电泳的概念l l 带电质点在电场中移动的现象带电质点在电场中移动的现象。二二.电泳技术分类电泳技术分类三三三三.电泳技术基本原理电泳技术基本原理电泳技术基本原理电泳技术基本原理 1.1.基本原理基本原理基本原理基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带不同的带电颗粒在同一
18、电场中泳动速度，主要与其所带不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。净电荷量，分子量及分子形状有关。净电荷量，分子量及分子形状有关。净电荷量，分子量及分子形状有关。pH pI pH pI 分子带负电荷分子带负电荷分子带负电荷分子带负电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动在电场中向正极移动在电场中向正极移动;pH pIpH 蛋蛋 GlyGlylm mcl cl cl clmm蛋蛋 蛋蛋m m GlyGly GlyGlyl凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子，Gly Gly为慢离子，为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。蛋白质样品被夹在中间。缓冲缓冲液液样品
19、样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶缓冲液成分及缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图浓缩效应示意图 快离子快离子 慢离子慢离子 蛋白质样品蛋白质样品 E：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)E E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓
20、缩。电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性lE：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括原
21、理包括：l缓冲液成分及缓冲液成分及pHpH的不连续性的不连续性l电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括原理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应
22、四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括原理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓
23、冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分
24、离胶分离胶 B.电荷效应电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离度增解离度增大，不存在快、慢离子之分，大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和蛋白质样品在均一电场强度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。l由于各种蛋白质由于各种蛋白质pI不同，所载有不同，所载有效电荷不同，因此质点的效电荷不同，因此质点的 有效有效迁移率不同，形成不同区带。迁移率不同，形成不同区带。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶 C.分子筛效应分子筛效应l分离胶的孔径小，各分子分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同受阻力不同，表现出不同的的 泳动速度，即分子筛作泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。形的泳动速度最快。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶