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1、第四章第四章 柠檬酸发酵机制柠檬酸发酵机制2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#重点：柠檬酸生物合成途径 柠檬酸生物合成的代谢调节机制 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制 2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#一、柠檬酸简介一、柠檬酸简介柠檬酸又名枸橼酸（柠檬酸又名枸橼酸（jyunsun），学名），学名-羟基丙烷羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基羟基丙三羧酸，英文文献俗名丙三羧酸，英文文献俗名citricacid，分子式，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微无色或白色晶体，无臭，味极酸
2、，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。第一节第一节 概述概述2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#食品工业：食品工业：酸味剂、增溶剂、抗氧化剂、防腐剂，除腥脱臭剂；医药工业：医药工业：枸橼酸根离子与钙离子能形成一种难于解离的可溶性络合物，因而降低了血中钙离子浓度，使血液凝固受阻。在输血或化验室血样抗凝时，用作体外抗凝药 化学工业：化学工业：鳌合剂，迅速沉淀金属离子 美容品、化妆品美容品、化妆品：加快角质更新，有助于皮肤的中黑色素的剥落，毛孔的收细，黑头的溶解 饲料业：饲料业：可以提早断奶，提高饲料利用率5%10%，增加母猪产仔量环保：环保：柠檬酸-柠
3、檬酸钠缓冲液用于烟气脱硫 二、柠檬酸及其盐的应用概况二、柠檬酸及其盐的应用概况2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#从柑橘提取 固态发酵（薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品）液态浅盘发酵（黑曲霉，泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉）深层发酵（黑曲霉/薯干粉）石油（石蜡油）解脂假丝酵母 50%提高至80%固定化细胞循环生物反应器发酵技术每生产1t柠檬酸分别消耗糖蜜，薯干粉或蔗糖。人们正在大力开发 2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#三、我国柠檬酸生产现状三、我国柠檬酸生产现状生产状况：生产状况：60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直
4、占国内总产量的界第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产以上。目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有家。主要有安徽丰原生物化安徽丰原生物化学集团公司学集团公司（生产能力为万吨（生产能力为万吨/年）、年）、江苏无锡罗氏中亚柠檬江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司酸有限公司（生产能力为万吨（生产能力为万吨/年）、年）、安徽华源生物药业有限安徽华源生物药业有限公司公司（生产能力为万吨（生产能力为万吨/年）等。年）等。存在问题：存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设
5、备利国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。，行业经济效益呈滑坡态势。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#第二节第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控柠檬酸合成途径与代谢调控1940年，年，Krebs:TCA；1953年，年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在证实黑曲霉中存在EMP途途径所有酶；径所有酶；1954年，年，Shu提出葡萄糖提出葡萄糖80%经经EMP途径代谢；途径代谢；1954-1955年，年，Ramakrishman等发现黑曲霉等发现黑曲霉中存在中存在TCA循环。循环。一、
6、柠檬酸合成途径的发现一、柠檬酸合成途径的发现2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰脱羧生成乙酰CoA，另一方面经，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。缩合生成柠檬酸。(1)生长期与产酸期都存在生长期与产酸期都存
7、在EMP与与HMP途径，前者途径，前者EMP:HMP=2:1，后者，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环和乙醛酸循环被被阻断或减弱阻断或减弱。(3)由于由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸草酰乙酸是由是由丙酮酸（丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。）羧化生成的。即由两个即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用固定化反应体系，其中以丙酮
8、酸羧化酶作用下固定化下固定化CO2生成草酰乙酸为主。生成草酰乙酸为主。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#1、磷酸果糖激酶（、磷酸果糖激酶（PFK）：）：Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响浓度对磷酸果糖激酶的影响（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节 Mn2+缺乏为何会使缺乏为何会使NH4+浓度升高呢浓度升高呢？当培养基中当培养基中Mn2+缺乏时，微生物体内积累几种氨基缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意
9、味等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样受到影响，这样NH4+的消耗下降，的消耗下降，NH4+浓度就会升高。浓度就会升高。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#2、丙酮酸羧化酶：、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。催化生成草酰乙酸。3、丙酮酸脱氢酶：、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰催化生成乙酰CoA2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#（二）三羧酸循环的调节（二）三羧酸循环的调节1、柠檬酸合成酶的调节：、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。循环第一个酶。
10、但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：顺乌头酸水合酶、顺乌头酸水合酶、NAD和和NADP-异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶在柠檬在柠檬酸产生与不产生时，这酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子，铁离子种酶均存在，而当铜离子，铁离子2mg/L和情况下，这和情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个在这个pH条件下积累的。条件下积累的。顺乌头酸水合酶顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸是催化柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸正逆反应的酶，研究表
11、明，黑曲霉中有一种单纯的位于线正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸柠檬酸:顺乌头酸顺乌头酸:异柠檬酸异柠檬酸90:3:7。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#3、-酮戊二酸脱氢酶的调节酮戊二酸脱氢酶的调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，循环的一个显著特点是，-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在当以葡萄糖为碳源时
12、，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。酮戊二酸脱氢酶或活力很低。-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCATCA循环中唯一不可循环中唯一不可逆反应，一旦逆反应，一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：TCATCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆逆TCATCA循环生成，使循环生成，使TCATCA循环成循环成“马蹄形马蹄形”。-酮戊酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#(三三)氧对柠檬酸积累的调节氧对柠檬酸积
13、累的调节乙酰乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：对柠檬酸发酵的作用为：(1)氧是发酵过程生成的氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。以外，还有一条侧系呼吸链。当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠
14、檬酸产酸急剧下降。呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸3醋酸醋酸1柠檬酸柠檬酸生成的柠檬酸一半转化为异生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸柠檬酸酵母酵母N源耗尽后开始烷烃发源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度酵，低浓度AMP抑制抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸顺乌头酸=90：7：3。细。细胞质中积累大量异柠檬酸。胞
15、质中积累大量异柠檬酸。乙醇乙醇乙酸乙酸2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#MnMn2+2+缺乏缺乏抑制蛋白合成抑制蛋白合成NHNH4 4+，有一条呼吸活动强的不产生，有一条呼吸活动强的不产生ATPATP的侧呼吸链：的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节解除磷酸果糖激酶的代谢调节解除磷酸果糖激酶的代谢调节解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进促进促进促进EMPEMPEMPEMP途径畅通。途径畅通。途径畅通。途径畅通。丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰酰CoACoA和和COCO2 2的固定两个反应的平衡，以及柠檬
16、酸合成酶不被调节，增强的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。了合成柠檬酸的能力。小结：小结：顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7同时控制同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。随着柠檬酸积累，随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。酶失活，更有利于柠檬酸的积累。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机
17、制#（五）柠檬酸发酵的产率（五）柠檬酸发酵的产率1、无、无CO2固定反应的产率固定反应的产率合成合成1分子柠檬酸需要分子柠檬酸需要3分子分子乙酰辅酶乙酰辅酶A，也就是需要分，也就是需要分子的葡萄糖。子的葡萄糖。理论产率为：理论产率为：192/(1801.5)=71.1%2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#2、通过、通过CO2固定反应提供固定反应提供C4二羧酸二羧酸2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#四、柠檬酸发酵过程的控制要点四、柠檬酸发酵过程的控制要点（1）控制）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对浓度，解除柠檬酸对PFK的的抑制，使抑制，使EMP畅通无阻。畅通无阻。（3
18、）控制培养基中的）控制培养基中的Fe2+的浓度，使顺乌头酸水的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。合酶失活。（2）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：1.透明圈大的菌株透明圈大的菌株平板：平板：10%甘薯甘薯+2%的琼脂的琼脂+0.5%CaCO3诱变后，涂布，透明圈大的则好诱变后，涂布，透明圈大的则好2.显色圈大小显色圈大小平板：麦汁培养基平板：麦汁培养基+pH值指示剂值指示剂诱变后，诱变后，33培养培养3天，透明圈大的则好。天，透明圈大的则好。2022/10/27第四章
19、 柠檬酸发酵机制#3.不分解柠檬酸的菌株不分解柠檬酸的菌株不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。4.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。（为何？中间产物少，（为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢架少，不利于合成代谢）2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#思考题思考题1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？何控制？2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。3.简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率的意义。的意义。2022/10/27第四章 柠檬酸发酵机制#