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1、天然产物分离技术四川大学华西药学院前 言 重要性 天然药物的开发（WTO，知识产权）提取 基础 分离 提取 1 文献 化学成分种类 2 系统预试 3 提取溶剂 a 水（鞣质、糖类、蛋白质）HCl NaOH 成盐溶出 冷水、热水 b 醇（乙醇、甲醇）95%-alkaloids 60-70%-皂苷、黄酮苷 40-50%-强心苷 c 丙酮、乙酸乙酯、苯等（苷元）4 提取方法 a 冷浸法（3-4次）优缺点 b 渗漉法（10倍量）受热易分解物 溶剂梯度 c 煎煮法（3-4次）水或稀醇 分离 1 分类 a 粗分（部位分离）b 细分（部位分组分离）c 单离（单体成分分离）2 方法 层析（平面层析、柱层析、逆
2、流层析）SFE 结晶平面层析 TLC 定性：预试 对照标准品 种类：硅胶 G,GF254 显色：广泛碘、H2SO4EtOH 专属alkaloids,flavonoids等 PTLC（Preparative TLC）制备量 g 级 1 吸附剂（adsorbents）材料：Silica gel 尺寸：20*20 20*40 厚度：0.5-2 mm 2 样品带 手工 自动点样器 样品带宽的解决方法 a 用极性流动相展开约2cm，使带变窄 b 用带浓缩带的板子 3 流动相选择 三角性法则 4 样品的收集洗脱 显色：定位 转移 洗脱 5 PTLC制备样品时引入的杂质 粘合剂 杂质 指示剂 Other (
3、分解物)(Al2O3 作吸附剂)难点 解决办法：Sephedex LH-20 6 技术发展 a HPTLC b 巨形板TLC 不锈钢板(60*60)厚度 5mm 上样量 10g c 带浓缩带TLC d 展开方式 多次展开（同方向）双向展开 e 移植TLC OPLC（Overpressure Layer Chromatography）又称 Overpressure TLC(OPTLC)1 简介 1979年 Tyihak 综合TLC,HPTLC 优点，吸收HPLC的某些特点。平面 细颗粒 蒸汽相 恒流速 2 装置 3 特点 a 与传统PTLC比较 b 效率 50mg0.5g 1h c 优点 4 制
4、备型OPLC 联机检测 分段收集 5 应用 氨基酸，多肽，胡萝卜素，生物碱等 离心薄层层析（CTLC）centrifugal TLC,Chromatotron 1 概述 CTLC是在TLC和柱色谱基础上发展起来 利用旋转离心力，连续洗脱 2 仪器 倾斜盘 流动相中央进入 梯度、UV检测、N2保护 固定相 活化 反复使用 3 特点 优点：（1）快速 30min （2）流动相少 （3）可反复使用 （4）进样方便 （5）直接洗脱 （6）直接检测，接收灵活 （7）可梯度洗脱 （8）占地小，移动方便 （9）分离杂质少 3 特点 缺点：（1）固定相限制 （2）Rf值 （3）显色 （4）收集污染 （5）上样
5、量少 4 应用 生物碱、人参皂苷 5 注意事项柱 层 析Column Chromatogrphy 常压柱层析(0.150g)（Ordinary Column Chromatogr.）吸附性柱色谱 分配性柱色谱 植物有效 柱色谱 离子交换柱色谱 成分分离 凝胶过滤柱色谱 主要手段 聚酰胺柱色谱 大孔吸附树脂一、吸附性柱层析 Al2O3 or Silica gel 生物碱 水溶性 Al2O3 甾体 脂溶性 Silica gel 挥发油 脂溶性 1 装柱 Al2O3：吸附剂:样品(2050:1)(20100:1)Silica：吸附剂:样品(30100:1)(300400:1)1)干法 与TLC吻合度
6、较好，溶剂消耗少 2)湿法 紧密，前沿整齐 2 上样 1)湿法 溶剂溶解上样（少量），低极性 2)干法 低极性溶剂溶解性差 3 洗脱 常压 低压 梯度洗脱 4 收集与检查 等份 TLC UV二、聚酰胺（Polyamide）1 原理 a 氢键吸附原理 酰胺键 酚类、酸类、醌类、硝基化合物 成氢键能力与溶剂有关 水甲醇乙醇丙酮稀氨液稀NaOH 氢键吸附规律：基团多少；基团位置；芳香核，共轭双键；分子内氢键 b 极性吸附原理 非极性脂肪链 萜类、甾体、生物碱 黄酮苷与苷元 非水（正相）含水（反相）2 聚酰胺粉的制备 国产（1530目）层析用（80100目）粗粉蒸馏水浸泡过夜，磨细，混悬液直接使用 抽
7、滤后，6080度烘干23小时备用 3 操作 a 装柱 细粉水浸泡装柱，自然沉降 b 上样 2030%水溶液上样 40-60:1 c 洗脱 水 含水醇 95%醇 3%NaOH 5%NaOH 4 再生 5%NaOH 三、分配性柱层析 1 原理 利用混合物在两相互不混溶中分配系数不同，而达 到分离的一种柱层析方法。分配系数差异愈大，分 离效果愈好。2 支持剂 硅胶、硅藻土、纤维粉 3 溶剂系统的选择 PC层析选择 4 操作 a 装柱 b 上样 c 洗脱 四、凝胶柱层析（Sephadex LH-20）1 葡聚糖凝胶简介 由葡聚糖凝胶Sephadex G-25交联亲脂性羟丙基而制备，是同时具备吸附层析、
8、分配色谱和分子筛功能的独特层析介质，溶剂系统没有限制，包括水相缓冲液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和各种混合溶剂，大量文献证明它非常适合于天然产物纯化，特别是中草药有效成分如甙类、生物碱、黄酮、蒽醌、内酯、帖类、甾类、多酚的分离。德国科学家Hans Henke著有Sephadex LH-20凝胶色谱分离专著，详尽叙述了Sephadex LH-20在植物化学研究中的应用。2 原理 分子筛：分子的大小和形状 吸附层析：被分离化合物与凝胶间的氢键 分配层析：被分离化合物在流动相（溶剂）和固定 相（凝胶）之间的分配 3 操作 a 装柱 洗脱剂溶胀后悬浮液搅拌装柱 b 上样 c 洗脱
9、水溶性好 水或电解质溶液 水溶性差 醇水或丙酮水 极性较小 丙酮、氯仿 d 浓缩 视情况而定 e 再生 洗脱剂平衡N NaOH-0.5N HCl 浸泡 水洗净-平衡 保存：50%丙酮水溶液 4 应用实例 例如，Sephadex LH-20层析分离川穹里的腺嘌呤，贝母里的腺苷浙贝宁、茄啶，日本附子里的乌头碱，银杏黄酮甙，夏枯草中的夏枯草黄酮苷、皂苷，升麻中的酰胺苷，水蔓菁中的水蔓菁萜苷，鹿衔草中的鹿蹄草苷，淫羊霍中的羊霍苷，多种中草药中的芦丁芸香苷，红花中的槲皮素、芦丁、山柰酚、红色素等多种黄酮，麦冬中的麦冬黄酮，鹿蹄草中的儿茶素，紫草中的萘醌、多酚。五、离子交换柱层析 1 原理 利用大分子树脂
10、网状结构内存在的交换基团而进行 的交换性柱层析方法。2 影响离子交换的因素 PH值 欲交换化合物的性质 欲交换化合物的浓度 温度 交换溶剂 交换流速 树脂用量 3 树脂的选择 李伯廷书91页 4 操作 a 树脂预处理 b 装柱 c 上样 d 交换 e 洗脱 f 树脂再生 5 实际应用 六、大孔吸附树脂层析 1 大孔吸附树脂简介大孔吸附树脂简介 大孔树脂吸附技术是上世纪七十年代发展起来的一种新工艺，是由苯乙烯、二乙烯或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构。药液通过大孔树脂吸附，其中的有效成分吸附在树脂上，再经洗脱回收，可除掉药液中杂质，是一种纯化精制药的有效方法。非极性吸附树脂在吸附药
11、液中成分时,主要是依靠物理结构（如比表面、孔径等）起作用，不同的树脂有不同的针对性。其操作的基本程序大多是：提取液通过大孔树脂吸附上有效成分的树脂洗脱洗脱液回收洗脱液干燥半成品。该技术目前已较广应用于新药的开发和生产中,主要用在分离和提纯过程中。2 大孔吸附树脂的优点 经大孔树脂吸附技术处理后，可有效地去除水煎液中大量的糖类、无机盐、黏液质等吸潮成分，有利于多种中药剂型的生产，增强产品的稳定性。大孔树脂吸附技术还能缩短生产周期,所需设备简单。免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序。3 大孔吸附树脂吸附机理 4 影响分离的因素 分子极性大小 分子体积 PH值 树脂柱的清洗 洗脱液的选择 5 操作 a
12、 树脂预处理 b 装柱 c 上样 d 洗脱 e 树脂再生 6 实际应用 适合中等程度的水溶性化合物 中药、天然色素，从 发酵液中得到抗生素、（青霉素先锋霉素螺旋霉素）蛋白质（胰岛素肽系抗生素）功能性食品添加剂 （维生素）等 聚苯乙烯合成吸附树脂吸附 含有电子的化合物如 含有苯环和共轭双键的化合物 甲基丙烯酸甲酯类吸附剂吸附 含羧基、酯基、氨基、酰胺基等与H可结合的官能团的化合物 特殊柱层析 （Special Column Chromatogr.）干柱柱层析 减压柱层析 植物有效成分 特殊柱层析 短柱柱色析 分离新方法 闪式柱色析 棒色谱 一、干柱柱层析 1 简介 2 特点 a 优点 分离效果比
13、湿法装柱高 可用薄层最佳分离条件直接套用 对有荧光或颜色的物质，可在紫外灯下将已分离的各层带分别切开，避免常规液相层析中因流出液收集不当而造成的层带交叉 适用于制备性分离 设备简单，消耗溶剂少，工时省，共轭双键；分子内氢键 b 缺点 样品容量比湿法装柱小，因此，消耗填充剂量大 3 原理 与薄层层析相同，借颗粒间的孔隙所产生的毛细作用而展层，因此，可套用薄层条件，分离效果亦相同。干填充剂颗粒的深孔内充满空气，溶剂和样品分子很难进入颗粒的深孔，吸附与解吸主要在外部表面进行。克服了样品分子由于进出填充剂深孔所造成的扩散及传质缓慢，因此其柱效比湿装柱高。a 种类（填充剂）氧化铝 活性 IIIV 吸附层
14、析 硅 胶 活性 IIIII 干柱 聚酰胺层析 分配层析 b 展开剂 多采用混合溶剂 避免溶剂解混产生，影响分离效果 解决办法：搭配极性相差适当的溶剂 如 石油醚乙醚 氯仿乙醇 石油醚乙醇 氯仿甲醇 苯、苯酚等不透过紫外光的溶剂对紫外光灯检出层带有影响 c 分离条件探索 探索和选择对样品分离度最大的填充剂和展开剂 薄层层析(最佳分离条件)同批次 d 样品容量 1:100 1:300 样品只能与吸附剂的外部表面接触 4 操作 a 柱的制备(常用50cm)聚乙烯薄膜柱 玻璃柱 b 加样和展开 加样：溶液加样；拌样加样 展开：c 层带的定位及分割 二、减压柱层析 （抽柱 Vacuum Liquid
15、Chromatography)1 简介 简便、实用、快速的层析方法，其基本原理与吸附层析相同，适用于较大量的制备性分离或提取物的极性分段划分。（粗分）2 操作 G-4垂熔玻砂漏斗或短粗柱、磨底抽滤瓶、减压泵及分部收集瓶组成。a 装柱 b 上样 c 洗脱 d 收集 3 注意事项 a 真空度 2070 mmHg b 洗脱剂极性 由小到大梯度递增 c 交叉色带 4 应用实例 二萜生物碱的分离 黄酮类化合物的分离 三、短柱柱层析 （抽柱 Vacuum Liquid Chromatography)短柱柱层析在制备量分离方面有独到之处，在微量成分的富集上有一定实用价值。1 短柱层析理论 经典色谱理论：柱效
16、随柱径的加大而下降，柱子愈长，分离越好，柱效越高。近来研究发现，此理论有一定局限性，在实践基础上，提出新的观点：柱径加大后，在适当条件下柱效反而提高。a 适当条件：柱径：3 20 cm 短粗柱 柱长：5 30 cm b 原因 (1)Knox 提出“无限直径效应”，认为柱短，柱径相对较粗，层析相对集中于中部进行，消除或减少了“柱壁效应”。(2)柱短，可使洗脱液在柱内受阻减少，且截面增大，使自然流速大大增加，为采用高细度吸附剂提供了可能条件。2 层析方法 同普通柱层析，不同之处在于采用短粗柱，使用吸附剂粒度细小，且粒度范围窄，装柱应尽量均匀。洗脱时多采用梯度洗脱，对洗脱剂选择较严格。3 注意事项
17、a 填料、洗脱剂 b Rf c 预纯化操作 四、闪式柱层析 （Flash Chromatography)20世纪700年代后发展起来的一种快速柱层析技术。1 简介 柱短，分离时间短，快，分离效率高。闪式硅胶（Flash Sicica gel）进口，国产（山东即墨化学试剂厂）球型微粒，粒度在40-63um(230-400目)之间（均匀）Kg/cm2 10mg-10g 样品 10-15min 2 操作 与普通柱层析法基本相同。a 装柱：湿法 干法（20cm）b 上样：拌样 湿法 c 洗脱：Rf 加液8-10cm，加压 3 实际应用 皂苷、甾体、生物碱、黄酮 五、棒色谱（Stick Chromato
18、graphy)1 简介 与制备型薄层层析原理相同,分离量大。把硅胶、氧化铝等制成园柱形的棒，下端上样，上行展开而达到分离目的。（吴凤鄂）2 操作 a 制棒 b 上样 c 展开 引导座两端相通，内填层析硅胶 展开装置层析槽，密封罩 d 收集 3 应用 生物碱、皂苷、甾醇等 加压柱层析 （Pressure Liquid Chromatogr.）类型 低压柱层析 加压柱层析 中压柱色析 高压柱色析 优点 分离因子 a 高，故能完成复杂的分离过程 a=两组分的相对保留时间之比 分离因子是评价色谱柱选择性的一种指标 制备型与分析型的区别：分析型：不要求样品回收 制备型：要求样品载量高，因此便要求有特殊的
19、层析 装置和操作系统 基本原理 1 加压柱层析效果的好坏 Speed 分析型 制备型 Resolution Load 与Load相关的因素 柱径 柱长 粒度 填充剂密度 2 加压柱层析目的 得出一个化合物 Lab.一定纯度 生产规模 回收率 单位时间内分得的化合物量 洗脱液流速快 可用更细的颗粒，分辨率提高 避免不稳定化合物在开口柱上由于长时间暴露而导致分解（最大优点）3 分类（Classifcaton）Analytical HPLC:ug-5mg Prep.HPLC:5 mg-gms Low-pressure LC:10mg-1g Medium-pressure LC:100 mg-100
20、g 选择制备型系统要考虑的事 以上各法的极限（适应范围）要分离的样品量 根据以上条件要求而选用的方法 柱大小，固定相，压力，洗脱剂 经验积累 4 操作 a TLC探索条件（层析系统选择）b 分析型小试 c 优化条件（超载）d 套用优化条件（制备）e 正式操作 f 获得纯品 g 分析鉴定纯品 h 再生柱 正相：actonewatermethanolTHF -dichloromethane 反相：water-methanol 5 Prep.LC的各种条件的应用情况及优化 a Column:loading,f,size,column efficiency,a,K number of theoreti
21、cal plates,resolution b Stationary phase:液液,固液,粒度大小 硅胶-普通,键合相 AgNO3coated silica gel-涂层AgNO3 分离萜类分开不同双键数目或位置 Paired-ion Chromatogr.-生物碱 在柱上增加一种离子,该离子与欲分离物相反,从而成为离子对,而成中性,易分离 Chiral stationary phase c 装柱技术 d 加样法（Sample introduction）e 加压泵（Pump）f 检测器（Detectors）g 流动相（Eluent）h 分离样品收集 i 切割与再循环技术 二个成分色带太近，
22、超出层析灵敏度范围，分不开时，采取的方法。（样品通过检测器不受破坏）j 柱超载及中心切割法 要想得量多，需超载，要用中心切割法纯化 注意检测器峰值 一、低压柱层析（Low-pressure LC）1 简介 低压柱层析可以用玻璃自制，现绝大多数是购买预制柱。长度：从240mm440mm 内径：从10mm37mm 外径：从13mm42mm L ID OD 进样量 B 310 25 28 1-5ml 1g C 440 37 42 2-10ml 3g 2 操作 a 填充剂 40-60um 与TLC相同，流速快 b 加压 氮气瓶 约5bar 机械泵 c 展开 d 收集 二、制备型HPLC 1 简介 g 流速 30-100ml/min 填料粒度 20-30um 最大压力 70bar 2 操作 a 装柱 b 上样 c 洗脱 d 收集三、中压柱层析（Medium-pressure LC）1 简介 载样量 1100g 流速 25-170ml/min 填料粒度 25-200um 最大压力 40bar 2 操作 a 装柱 b 上样 c 洗脱 d 收集