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1、第第第第 五五五五 章章章章动物细胞制药动物细胞制药动物细胞制药动物细胞制药第一节第一节第一节第一节 概概概概 述述述述细胞学说的建立细胞学说的建立细胞学说的建立细胞学说的建立组织培养和细胞培养组织培养和细胞培养组织培养和细胞培养组织培养和细胞培养细胞工程学细胞工程学细胞工程学细胞工程学第二节动物细胞的形态第二节动物细胞的形态第二节动物细胞的形态第二节动物细胞的形态和生理特点和生理特点和生理特点和生理特点 一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态 适应功能适应功能适应功能适应功能,形态各异。形态各异。形态各异。形态各异。离体培养细胞分两类：离体培养细胞分两类：离
2、体培养细胞分两类：离体培养细胞分两类：贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞贴壁细胞贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面，生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴自身分泌或培养基中提供的贴 附因子才能在该表面上生长。附因子才能在该表面上生长。两种形态：两种形态：成纤维成纤维细胞型细胞型 上皮上皮细胞型细胞型悬浮细胞悬浮细胞 生长不依赖生长不依赖支持物表面，在培养支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴液中呈悬浮状态生长。如淋巴细细胞。胞。兼性兼性贴壁细胞贴壁细胞 生长不严格依赖生长不严格依赖支持物。如中国支持物。如中国地鼠卵巢地鼠卵巢细胞，小细胞，小鼠
3、鼠L929细胞。细胞。二、动物细胞的生理特点二、动物细胞的生理特点 细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为细胞分裂时间为细胞分裂时间为细胞分裂时间为121248h48h，细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂 周期周期周期周期=间期间期间期间期+分裂期分裂期分裂期分裂期 间期（间期（间期（间期（GG1 11+S+G+S+G2 22）分裂期（分裂期（分裂期（分裂期（MM）G1 1期：期：46h 合成合成DNA聚合酶聚合酶 RNA合成合成S期：期：68h DNA合成合成G2 2期：期：25h DNA量加倍量加倍,RNA合成合成M期：期：0.51h 染色体
4、分裂染色体分裂细胞代数为细胞分裂次数细胞代数为细胞分裂次数细胞代数为细胞分裂次数细胞代数为细胞分裂次数传代数表示细胞培养分种传代次数传代数表示细胞培养分种传代次数传代数表示细胞培养分种传代次数传代数表示细胞培养分种传代次数细胞代数细胞代数细胞代数细胞代数=传代数传代数传代数传代数 分种数分种数分种数分种数/2/2X=(logN-logNX=(logN-logNo o)log2)log2 X X 代数代数代数代数 N N 培养最终细胞数培养最终细胞数培养最终细胞数培养最终细胞数 N No o 培养起始细胞数培养起始细胞数培养起始细胞数培养起始细胞数倍增时间倍增时间倍增时间倍增时间=培养经过时间培
5、养经过时间培养经过时间培养经过时间 代数代数代数代数细胞生长需贴附于基质细胞生长需贴附于基质细胞生长需贴附于基质细胞生长需贴附于基质,并有接并有接并有接并有接 触抑制现象。触抑制现象。触抑制现象。触抑制现象。正常二倍体细胞的生长寿命是正常二倍体细胞的生长寿命是正常二倍体细胞的生长寿命是正常二倍体细胞的生长寿命是 有限的。有限的。有限的。有限的。原代培养原代培养原代培养原代培养 有限细胞系有限细胞系有限细胞系有限细胞系 无限细胞系无限细胞系无限细胞系无限细胞系动物细胞对周围环境十分动物细胞对周围环境十分动物细胞对周围环境十分动物细胞对周围环境十分 敏感敏感敏感敏感;对理化因素敏感，如：对理化因素
6、敏感，如：对理化因素敏感，如：对理化因素敏感，如：渗透压、渗透压、渗透压、渗透压、pHpH、离子浓度、剪切、离子浓度、剪切、离子浓度、剪切、离子浓度、剪切 力、微量元素等。力、微量元素等。力、微量元素等。力、微量元素等。动物细胞对培养基要求高动物细胞对培养基要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。长因子、贴壁因子等。动物细胞蛋白质的合成途动物细胞蛋白质的合成途动物细胞蛋白质的合成途动物细胞蛋白质的合成途 径和修饰径和修饰径和修饰径和修饰 功能与细菌不同。功能与细菌不同。功能与细菌不同。功能与细菌不同。
7、动物细胞蛋白质的合成部位：动物细胞蛋白质的合成部位：动物细胞蛋白质的合成部位：动物细胞蛋白质的合成部位：游离核糖体游离核糖体游离核糖体游离核糖体 粗面内质网的核糖体粗面内质网的核糖体粗面内质网的核糖体粗面内质网的核糖体 游离核糖体游离核糖体游离核糖体游离核糖体合成蛋白质用于合成蛋白质用于合成蛋白质用于合成蛋白质用于 细胞质基质内。细胞质基质内。细胞质基质内。细胞质基质内。粗面内质网的核糖体粗面内质网的核糖体粗面内质网的核糖体粗面内质网的核糖体合成蛋合成蛋合成蛋合成蛋 白质是分泌的和膜中的整合白质是分泌的和膜中的整合白质是分泌的和膜中的整合白质是分泌的和膜中的整合 蛋白多为糖蛋白。蛋白多为糖蛋白
8、。蛋白多为糖蛋白。蛋白多为糖蛋白。动物细胞生产药物动物细胞生产药物动物细胞生产药物动物细胞生产药物缺点缺点缺点缺点:培养条件高、成本贵、产量培养条件高、成本贵、产量培养条件高、成本贵、产量培养条件高、成本贵、产量低。低。低。低。优点优点优点优点:分泌胞外、纯化方便、翻译分泌胞外、纯化方便、翻译分泌胞外、纯化方便、翻译分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。后修饰糖基化，与天然产品一致。后修饰糖基化，与天然产品一致。后修饰糖基化，与天然产品一致。第三节生产用动物细胞的第三节生产用动物细胞的要求和获得要求和获得 一、生产用动物细胞的要求一、生产用动物细胞的要求一、生产用动物细胞的要
9、求一、生产用动物细胞的要求 原代细胞原代细胞原代细胞原代细胞 二倍体细胞系二倍体细胞系二倍体细胞系二倍体细胞系 转化细胞系转化细胞系转化细胞系转化细胞系二、生产用动物细胞的获得二、生产用动物细胞的获得原代细胞原代细胞是直接取自动物组织器官是直接取自动物组织器官,经过粉经过粉碎消化而获得的细胞悬液（碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。）。需要大量动物，费钱费劳力。需要大量动物，费钱费劳力。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。淋巴细胞。二倍体细胞系二倍体细胞系原代细胞经过传代筛选克隆，原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑从多种细胞成分的组
10、织中，挑 选并纯化出某种具有一定特征选并纯化出某种具有一定特征 的细胞株。的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的二倍体细胞有正常细胞的特点：特点：染色体组型是染色体组型是2n核型；核型；贴壁依赖接触抑制；贴壁依赖接触抑制；可传代培养可传代培养50代；代；无致瘤性。无致瘤性。二二二二倍倍倍倍体体体体细细细细胞胞胞胞 转化细胞系转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常通过某个转化过程形成的，常 由于染色体断裂变成异倍体，由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无失去正常细胞特点，而获得无 限增殖能力。转化过程可以是限增殖能力。转化过程可以是 自发的，和人工的，从肿瘤组自发的，和人工的，从肿瘤组
11、织中。织中。三、常用生产用动物细胞三、常用生产用动物细胞的特性的特性 W1-38 W1-38 W1-38 W1-38：正常胚肺组织人二倍体正常胚肺组织人二倍体正常胚肺组织人二倍体正常胚肺组织人二倍体 细胞系。细胞系。细胞系。细胞系。核型为核型为核型为核型为2n=462n=46。成纤维细胞，。成纤维细胞，。成纤维细胞，。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用能产生胶原，培养基用能产生胶原，培养基用能产生胶原，培养基用BME BME （Eagle Basal mediumEagle Basal medium）。）。）。）。10%小牛血清，小牛血清，pH7.2,同工酶为同工酶为G6PD B型。型。倍增时间
12、为倍增时间为24h，有限寿命有限寿命50代。代。安全，用于制备疫苗。安全，用于制备疫苗。MRC-5MRC-5MRC-5MRC-5：从正常男性肺组织从正常男性肺组织从正常男性肺组织从正常男性肺组织 中获得的人二倍体细胞系。中获得的人二倍体细胞系。中获得的人二倍体细胞系。中获得的人二倍体细胞系。核型为核型为核型为核型为2n=462n=46。属成纤维细胞。属成纤维细胞。属成纤维细胞。属成纤维细胞。培养基用加小牛血清。培养基用加小牛血清。培养基用加小牛血清。培养基用加小牛血清。同工酶同工酶同工酶同工酶G6PD BG6PD B型。型。型。型。有限寿命有限寿命4246代。增殖代。增殖 速度较速度较W1-3
13、8快，对不良快，对不良 环境敏感性较环境敏感性较W1-38低。低。对人的病毒敏感。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。用于生产疫苗。CHO-K1CHO-K1CHO-K1CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分从中国地鼠卵巢中分从中国地鼠卵巢中分从中国地鼠卵巢中分 离的上皮样细胞。离的上皮样细胞。离的上皮样细胞。离的上皮样细胞。核型：核型：核型：核型：2n=20 2n=202222。培养基：培养基：培养基：培养基：DEMEDEME培养基培养基培养基培养基mmol/Lmmol/L次黄嘌呤，次黄嘌呤，次黄嘌呤，次黄嘌呤，mmol/Lmmol/L胸苷，胸苷，胸苷，胸苷，10%10%小牛血清，小牛血清，小牛血清，小牛
14、血清，加入脯氨酸。加入脯氨酸。加入脯氨酸。加入脯氨酸。BHK-21 BHK-21 BHK-21 BHK-21:从从从从5 5 5 5只无性别的生长只无性别的生长只无性别的生长只无性别的生长1 1 1 1天的地天的地天的地天的地鼠幼鼠肾脏中分离的鼠幼鼠肾脏中分离的鼠幼鼠肾脏中分离的鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞成纤维样细胞成纤维样细胞成纤维样细胞,核型为核型为核型为核型为2n=44;2n=44;2n=44;2n=44;培养基为培养基为培养基为培养基为DMEMDMEMDMEMDMEM加加加加7%7%7%7%胎牛胎牛胎牛胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、血清。
15、用于增殖病毒，包括多瘤病毒、血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。现已用于工程细胞构建。现已用于工程细胞构建。现已用于工程细胞构建。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。作疫苗，现已用于工程细胞构建。Vero Vero Vero Vero：从正常成年非洲绿猴：从正常成年非洲绿猴：从正常成年非洲绿猴：从正常成年非洲绿猴 肾脏分离的。肾脏分离的。肾
16、脏分离的。肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，为贴壁依赖的成纤维细胞，为贴壁依赖的成纤维细胞，为贴壁依赖的成纤维细胞，核型核型核型核型2n=602n=602n=602n=60；培养基为培养基为199199培养基，培养基，加加5%5%胎牛血清；用于增殖病毒，胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。狂犬病毒。Namalwa Namalwa Namalwa Namalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病：从肯尼亚患有淋巴瘤病：从肯尼亚患有淋巴瘤病：从肯尼亚患有淋巴瘤病 人获取，建成的人的类淋巴母细胞。人获取，建成的人的类淋巴母细胞。人获取，建成的人的类淋巴母细胞。
17、人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%2.8%2.8%2.8%的高倍体率，的高倍体率，的高倍体率，的高倍体率，1212121214141414条标记染条标记染条标记染条标记染 色体。单条色体。单条色体。单条色体。单条X X X X，无，无，无，无Y Y Y Y。培养基为。培养基为。培养基为。培养基为RPMI RPMI RPMI RPMI 1640164016401640，添加，添加，添加，添加7%7%7%7%胎牛血清。用于生产胎牛血清。用于生产胎牛血清。用于生产胎牛血清。用于生产 干扰素。干扰素。干扰素。干扰素。SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14
18、：通过融合的方法，：通过融合的方法，：通过融合的方法，：通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的从有羊抗红细胞活性的从有羊抗红细胞活性的从有羊抗红细胞活性的BALB/cBALB/cBALB/cBALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8P3X63Ag8P3X63Ag8P3X63Ag8融合杂交瘤融合杂交瘤融合杂交瘤融合杂交瘤SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，亚克隆中分离获得，亚克隆中分离获得，亚克隆中分离获得，能耐受能耐受8 8氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤
19、20g/ml 20g/ml但但 在含在含HAT HAT 选择培养基中不能存活。选择培养基中不能存活。通常用培养基为通常用培养基为DMEMDMEM，添加，添加10%10%胎胎 牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞 和抗体。和抗体。Sf-9 Sf-9 Sf-9 Sf-9 1983198319831983年从亲代年从亲代年从亲代年从亲代IPLBSF21AEIPLBSF21AEIPLBSF21AEIPLBSF21AE 中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的 蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蛹卵组织中
20、分离获得。它对苜宿尺蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺 蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒 高度敏感。高度敏感。高度敏感。高度敏感。通常用的培养基为通常用的培养基为GraceGrace培养基，培养基，添加添加g/L g/L 水解乳蛋白和水解乳蛋白和g/Lg/L酵母浸液酵母浸液,10%,10%胎牛血清。用于高胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。效表达外来蛋白制品。四、基因工程细胞构建和四、基因工程细胞构建和四、基因工程细胞构建和四、基因工程细胞构建和筛选筛选筛选筛选 在生产中采用更多的
21、更有前景的是在生产中采用更多的更有前景的是在生产中采用更多的更有前景的是在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各融合细胞及采用基因工程构建的各融合细胞及采用基因工程构建的各融合细胞及采用基因工程构建的各 种工程细胞。种工程细胞。种工程细胞。种工程细胞。被用构建工程细胞的动被用构建工程细胞的动 物细胞有：物细胞有：CHO-dhfr CHO-dhfr、BHK-21BHK-21、Namalwa Namalwa、VeroVero、SP2/0 SP2/0、Sf-9 Sf-9 等细胞。等细胞。真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表
22、达载体的构建使用的载体有两类：使用的载体有两类：使用的载体有两类：使用的载体有两类：病毒载体病毒载体病毒载体病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒杆状病毒杆状病毒杆状病毒质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体 牛痘病毒：牛痘病毒：用构建多价疫苗用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。用于基因治疗。杆状病毒：杆状病毒：用于外源基因表达用于外源基因表达。其作为载体的其作为载体的 优点：优点：双链双链DNA，易重组，易重组 插入插入78kb DNA不影响正不影响正 常病毒粒子的
23、形成。常病毒粒子的形成。多角体蛋白和病毒粒子的形多角体蛋白和病毒粒子的形多角体蛋白和病毒粒子的形多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因成无直接关系，因此用外源基因成无直接关系，因此用外源基因成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成更换多角体蛋白基因，仍能形成更换多角体蛋白基因，仍能形成更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；有感染力病毒粒子；有感染力病毒粒子；有感染力病毒粒子；多角体蛋白基因有非常强的多角体蛋白基因有非常强的 启动子，产生的蛋白质可占全启动子，产生的蛋白质可占全 部蛋白质的部蛋白质的20%20%30%30%；用光学显微镜可看到多角体，用光学显
24、微镜可看到多角体，用光学显微镜可看到多角体，用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克可以此作为标记物，选阳性克可以此作为标记物，选阳性克可以此作为标记物，选阳性克 隆。隆。隆。隆。如用家蚕杆状病毒，还可在蚕如用家蚕杆状病毒，还可在蚕如用家蚕杆状病毒，还可在蚕如用家蚕杆状病毒，还可在蚕 体表达外源基因。体表达外源基因。体表达外源基因。体表达外源基因。质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体在细菌和哺乳动物细胞在细菌和哺乳动物细胞在细菌和哺乳动物细胞在细菌和哺乳动物细胞 体内都能扩增。都含有如下基本体内都能扩增。都含有如下基本体内都能扩增。都含有如下基本体内都能扩增。都含有如下基本 成分：成分
25、：成分：成分：允许载体在细菌体内扩增的质允许载体在细菌体内扩增的质允许载体在细菌体内扩增的质允许载体在细菌体内扩增的质 粒序列。粒序列。粒序列。粒序列。含有使基因表达的调控元件。含有使基因表达的调控元件。含有使基因表达的调控元件。含有使基因表达的调控元件。能用以筛选出外源基因已整能用以筛选出外源基因已整 合的选择标记。合的选择标记。有时还带有选择性增加拷贝有时还带有选择性增加拷贝 数的扩增系统。数的扩增系统。基因载体的导入和高效表达工程细胞株基因载体的导入和高效表达工程细胞株基因载体的导入和高效表达工程细胞株基因载体的导入和高效表达工程细胞株 的筛选的筛选的筛选的筛选 基因载体导动物细胞基因载
26、体导动物细胞基因载体导动物细胞基因载体导动物细胞 常用方法是常用方法是常用方法是常用方法是：磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法 磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法：溶解的溶解的DNA 加加Na2HPO4和和CaCl2 形成磷酸钙沉淀，形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，被包在磷酸钙沉淀中，形成形成DNA磷酸钙共沉淀物，当磷酸钙共沉淀物，当 和细胞表面接触时，则通过细胞和细胞表面接触时，则通过细胞 吞噬作用而将吞噬作用而将DNA导入。导入。电穿孔法：电穿孔法：借助电穿孔仪的高压脉冲电场，借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，使细胞膜
27、出现瞬时可逆性小孔，外源外源DNA沿小孔进入细胞。转沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。化率较高，拷贝数低。五、细胞库的建立五、细胞库的建立五、细胞库的建立五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立生产用的工程细胞必须建立生产用的工程细胞必须建立生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：两个细胞库：两个细胞库：两个细胞库：原始细胞库原始细胞库原始细胞库原始细胞库 生产用细胞库生产用细胞库生产用细胞库生产用细胞库原始细胞库贮存时须有该细原始细胞库贮存时须有该细原始细胞库贮存时须有该细原始细胞库贮存时须有该细 胞的详细挡案，包括：胞的详细挡案，包括：胞的详细挡案，包括：胞的详细挡案，包括：该细胞系的历史该细胞系的历史该细胞系的历史该细胞系的历史 该细胞系的特性该细胞系的特性该细胞系的特性该细胞系的特性 对各种有害因子的检查结果对各种有害因子的检查结果对各种有害因子的检查结果对各种有害因子的检查结果 生产用细胞库生产用细胞库 从原始细胞库来的，或从单从原始细胞库来的，或从单 一安瓶来，或从多个安瓶来一安瓶来，或从多个安瓶来 即刻混合，经培养扩增再分即刻混合，经培养扩增再分 装储存形成细胞库。装储存形成细胞库。需建挡案，需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污进行无菌性无细胞交叉污 染的检查。染的检查。需确定最高使用的传代数。需确定最高使用的传代数。