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1、10 DNA的生物合成的生物合成n10.1 半保留复制半保留复制n10.2 参与参与DNA生物合成的酶生物合成的酶n10.3 以以DNA为模板合成为模板合成DNA的过程的过程n10.4 DNA损伤与修复损伤与修复n10.5 以以RNA为模板合成为模板合成DNA的过程的过程10.1 半保留复制半保留复制n10.1.1 半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据n10.1.2 半保留复制的意义半保留复制的意义DNA 复制复制是半是半保留保留复制复制10.1.1 半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据10.1.2 半保留复制的意义半保留复制的意义n按半保留复制的方式，子代保留了亲按半保留复制的方式，
2、子代保留了亲代代 DNA 的全部遗传信息的全部遗传信息，保证了遗，保证了遗传信息的相对稳定，是物种稳定性的传信息的相对稳定，是物种稳定性的分子基础。分子基础。10.2 参与参与DNA生物合成的酶生物合成的酶n10.2.1 DNA聚合酶聚合酶n10.2.2 DNA分子的拓扑学变化和相关酶分子的拓扑学变化和相关酶n10.2.3 引物酶引物酶n10.2.4 DNA连接酶连接酶10.2.1 DNA聚合酶聚合酶n以以 DNA 聚合酶聚合酶I 为代表说明三个酶为代表说明三个酶的共性的共性:（1）是一个模板指导酶。）是一个模板指导酶。（2）聚合需要引物。）聚合需要引物。（3）具有水解作用。具有水解作用。（1
3、）模板指导酶）模板指导酶 即需要打开的即需要打开的 DNA 单链作为模板才能单链作为模板才能合成子链。此酶催化的底物：必须是脱氧的合成子链。此酶催化的底物：必须是脱氧的核苷核苷 5-三磷酸（三磷酸（dATP、dGTP、dTTP和和dCTP）；）；只有当所有只有当所有 4 种脱氧核苷三磷酸以及种脱氧核苷三磷酸以及 DNA 模板存在时，才能实现模板存在时，才能实现 DNA 的合成。的合成。（2）需要引物）需要引物 DNA 聚合酶聚合酶只能将脱氧核苷酸只能将脱氧核苷酸加于已存在的加于已存在的DNA 或或 RNA 链的链的 3-羟羟基上，否则不能合成。基上，否则不能合成。这是一个耗能反应，每合成一个核
4、这是一个耗能反应，每合成一个核苷酸消耗苷酸消耗 2 分子分子ATP。聚合反应是延着聚合反应是延着 53 的方向进行。的方向进行。（3）具有水解作用具有水解作用n3 5外切活力的作用：外切活力的作用：复制复制“校对校对”作作用。用。从从DNA 链链 3-羟基端逐个水解成单核苷酸的作用。羟基端逐个水解成单核苷酸的作用。n53 外切活力的作用：外切活力的作用：从从 5 端切去端切去 引物引物 RNA 的功能。的功能。从从 5 端对端对 DNA 进行水解的作用。进行水解的作用。这两种酶活性称为这两种酶活性称为DNA 聚合酶的外切活力，对聚合酶的外切活力，对 DNA 的复制都的复制都是十分重要的。是十分
5、重要的。大肠杆菌大肠杆菌体内各聚合酶作用：体内各聚合酶作用：n聚合酶聚合酶 是复制时的主要聚合酶；是复制时的主要聚合酶；n聚合酶聚合酶 I 主要负责消除引物并用脱氧核主要负责消除引物并用脱氧核苷酸填满内隙；苷酸填满内隙；n聚合酶聚合酶的作用尚不清楚。的作用尚不清楚。nDNA聚合酶聚合酶和和 它们涉及它们涉及DNA的错的错误倾向修复。误倾向修复。当当DNA受到严重损伤时，既可诱导受到严重损伤时，既可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性，因而出现高突变产生这两个酶，使修复缺乏准确性，因而出现高突变率。它能在率。它能在DNA 许多损伤部位继续复制，在跨越损许多损伤部位继续复制，在跨越损伤部位时就造成了
6、错误倾向的复制。高突变率虽会杀伤部位时就造成了错误倾向的复制。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。的细胞得以存活。DNA 聚合酶聚合酶：它至少由它至少由 8 种亚基组成。这种组装体使酶的催化种亚基组成。这种组装体使酶的催化能力、准确性大为提高。它紧紧地结合于模板，每能力、准确性大为提高。它紧紧地结合于模板，每秒钟聚合秒钟聚合 1000 多个核苷酸。多个核苷酸。许多亚基的功能目前还不清楚，许多亚基的功能目前还不清楚，已知催化活性已知催化活性位于位于亚基，亚基，亚基大约把酶的核心夹于模板上，从亚基大约把酶的核心夹
7、于模板上，从而提高全酶的工作能力，而提高全酶的工作能力，35核酸外切酶活性位核酸外切酶活性位于于亚基。聚合酶亚基。聚合酶全酶形成一个对称的二聚体。全酶形成一个对称的二聚体。这种结构使复制的先导链及后随链在全酶上同时、这种结构使复制的先导链及后随链在全酶上同时、同方向合成。同方向合成。真核生物的真核生物的 DNA聚合酶聚合酶n真核生物真核生物DNA聚合酶现已发现至少有聚合酶现已发现至少有5种，分别称为种，分别称为DNA-pol、。nDNA-pol 和和都是在复制延长中起催化都是在复制延长中起催化作用。作用。DNA-pol 则与原核生物的则与原核生物的DNA-pol I相似，在复制过程中起校读、修
8、复相似，在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。和填补缺口的作用。nDNA-pol 也只是在没有其他也只是在没有其他DNA-pol时时才发挥催化功能。才发挥催化功能。10.2.2 DNA分子的拓扑学变化和相关酶分子的拓扑学变化和相关酶n10.2.2.1 解螺旋酶解螺旋酶n10.2.2.2 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶n10.2.2.3 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白10.2.2.1 解螺旋酶解螺旋酶n一一种种称称为为解解螺螺旋旋酶酶或或解解螺螺旋旋酶酶，与与随随后后链链的的模模板板DNA结结合合，沿沿53方方向向运运动动；一一种种称称为为Rep蛋蛋白白，和和前前导导链链的的模板模板DNA结合，
9、沿结合，沿35方向运动方向运动。10.2.2.2 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶n原原核核生生物物中中与与复复制制有有关关的的主主要要是是DNA拓拓扑扑异异构构酶酶，又又称称DNA解解旋旋酶酶（DNA gyrase），发挥作用需发挥作用需ATP水解供能。水解供能。n真真 核核 生生 物物 中中 Topo和和 均均 与与 复复 制制 有有 关关。Topo不不需需消消耗耗ATP，其其酪酪氨氨酸酸残残基基能能与与DNA3-磷磷酸酸基基团团形形成成共共价价结结合合的的中中间间产产物物，它能使负或正超螺旋变为松驰态。它能使负或正超螺旋变为松驰态。Topo的的存存在在需需要要ATP供供能能，它它不不仅仅参参与
10、与DNA复制，还促进两个子代分子的分离。复制，还促进两个子代分子的分离。10.2.2.3 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白n解螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了解螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链一段单链区，但是这种单链DNA不会长不会长久存在，会很快重新配对形成双链久存在，会很快重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。或被核酸酶降解。nSSBP能很快地和单链能很快地和单链DNA结合，防止其结合，防止其重新配对形成双链重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。或被核酸酶降解。10.2.3 引物酶（引物酶（Primerase）所有的所有的 DNA 聚合酶都要求一个有自由聚合酶都要求一
11、个有自由 3-OH 的引物来起始的引物来起始 DNA 的合成。这段的合成。这段 RNA 长长 5-10 个核苷酸，由一种特异的个核苷酸，由一种特异的 RNA 聚合酶合成，此酶称为引物酶聚合酶合成，此酶称为引物酶。引物及引物酶的作用：引物及引物酶的作用：这与这与 DNA聚合酶聚合酶 的高度忠实性复制分不开。的高度忠实性复制分不开。已知已知 DNA聚合酶具有聚合酶具有 3 5 的外切作用以校对复的外切作用以校对复制中的错误核苷酸。也就是说聚合酶在开始形成一个制中的错误核苷酸。也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总先要检查前一个碱基是否正确，新的磷酸二酯键前，总先要检查前一个碱基是否正确，
12、这就决定了它不能从头开始合成。这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始因此先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始 DNA 的合的合成，并以核糖核苷酸来标记是成，并以核糖核苷酸来标记是“暂时暂时”的。这种高度精确的安的。这种高度精确的安排增加了排增加了 DNA 复制的复杂性，却保证了复制的忠实性。已知复制的复杂性，却保证了复制的忠实性。已知复制的误差率仅为十亿分之一至百亿分之一，即复制十亿到复制的误差率仅为十亿分之一至百亿分之一，即复制十亿到一百亿个碱基才可能出一个差错。一百亿个碱基才可能出一个差错。10.2.4 DNA连接酶连接酶 催化两条催化两条 DNA 单链连接起来
13、或把单条单链连接起来或把单条 DNA 链闭合起来。链闭合起来。10.3 以以DNA为模板合成为模板合成DNA的过程的过程n10.3.1 复制的起始复制的起始n10.3.2 复制的延伸复制的延伸n10.3.3 复制的终止复制的终止10.3.1 复制的起始复制的起始n（1）4 个个 danA 蛋白结合蛋白结合与复制与复制原点原点（origin）上上的的 danA 蛋白结合蛋白结合部位蛋白。部位蛋白。n（2）接着接着danB 和和 danC 等蛋白复合物进等蛋白复合物进入入 DNA 的熔解区形成前引物化复合物。的熔解区形成前引物化复合物。n（3）前引物化复合物形成后，导致模板）前引物化复合物形成后，
14、导致模板 DNA 双螺旋解链，解螺旋的双螺旋解链，解螺旋的 DNA部分被部分被单链结合蛋白结合，保持伸展状态，形成单链结合蛋白结合，保持伸展状态，形成单链模板。单链模板。n（4）引物合成：接着，引物酶也结合于单）引物合成：接着，引物酶也结合于单链模板上开始合成链模板上开始合成 RNA 引物。引物。danA 蛋白结合时要求双螺旋蛋白结合时要求双螺旋 DNA 必须是负超必须是负超螺旋状态，识别起始原点的螺旋状态，识别起始原点的 作用。作用。danB 蛋白是解螺旋酶蛋白是解螺旋酶，它催化由它催化由 ATP 推动的推动的双螺旋双螺旋 DNA 的解链。的解链。10.3.2 复制的延伸复制的延伸n引物引物
15、 RNA 合成完成后，合成完成后，DNA聚合聚合 全全酶酶 进入已形成的复制叉上，它已合成的进入已形成的复制叉上，它已合成的引物引物 RNA开始延伸子链。开始延伸子链。在聚合酶在聚合酶 全酶的前头，还有一个全酶的前头，还有一个 rep 蛋白，蛋白，它像起始部位的它像起始部位的 dnaB 蛋白一样是一个解螺旋酶使复蛋白一样是一个解螺旋酶使复制叉得以推进，制叉得以推进，SSB 再次保持解链的再次保持解链的 DNA 单链处于单链处于伸展状态而使之起模板作用，伸展状态而使之起模板作用，DNA 促旋酶则同时引促旋酶则同时引入负超螺旋，以避开拓扑学上的危机，以利聚合酶入负超螺旋，以避开拓扑学上的危机，以利
16、聚合酶 全酶在两条模板不断延伸。全酶在两条模板不断延伸。先导链和随后链同时同方向合成先导链和随后链同时同方向合成：完整的随后链的形成：完整的随后链的形成：半保留半不连续复制：半保留半不连续复制：DNA 复制时子链双链中有一条复制时子链双链中有一条来源于母链，以来源于母链，以 DNA 母链双链为母链双链为模板合成子链时模板合成子链时,其中一条子链的其中一条子链的合成是不连续的合成是不连续的,而另一条链的合而另一条链的合成是连续的。成是连续的。10.3.3 复制的终止复制的终止（3）复制的终止）复制的终止 复制具有终止（复制具有终止（termination）位置。在大肠位置。在大肠杆菌里，由于基因
17、组是一环型杆菌里，由于基因组是一环型 DNA，两个复两个复制叉向前推移，最后在终止区相遇并停止复制。制叉向前推移，最后在终止区相遇并停止复制。10.4 DNA损伤与修复损伤与修复n DNA的损伤的损伤n10.4.2 损伤修复系统损伤修复系统 DNA的损伤的损伤n某些化学、物理的因素可引起细胞某些化学、物理的因素可引起细胞 DNA 的损伤（化学结构发生改变）。化学因的损伤（化学结构发生改变）。化学因素种类繁多，机制也很复杂；物理因素素种类繁多，机制也很复杂；物理因素中紫外线的作用机制研究得比较清楚。中紫外线的作用机制研究得比较清楚。例如例如形成胸腺嘧啶二聚体。形成胸腺嘧啶二聚体。此外，此外，DN
18、A 的损伤还有碱基可能改变或丢失、骨架的损伤还有碱基可能改变或丢失、骨架中的磷酸二酯键可能断裂，螺旋链可能中的磷酸二酯键可能断裂，螺旋链可能形成交联等。形成交联等。胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体:紫外线引起紫外线引起 DNA 分子中同一条链上相邻的两个分子中同一条链上相邻的两个嘧啶核苷酸以共价键连接生成环丁烷结构，即嘧啶嘧啶核苷酸以共价键连接生成环丁烷结构，即嘧啶二聚体。二聚体。最易见的是胸腺嘧啶二聚体。此种二聚体不能容最易见的是胸腺嘧啶二聚体。此种二聚体不能容纳在双螺旋结构中，它不能与互补链上的腺嘌呤形成氢键配纳在双螺旋结构中，它不能与互补链上的腺嘌呤形成氢键配对，影响对，影响 DNA 的复制
19、和基因表达。的复制和基因表达。10.4.2 损伤修复系统损伤修复系统n修复作用是一种普遍的功能。不论物理修复作用是一种普遍的功能。不论物理因素或化学因素所造成的损伤，只要因素或化学因素所造成的损伤，只要 DNA 结构发生改变，就能被修复酶识别，结构发生改变，就能被修复酶识别，而把不正常的部分切除。修复对保护而把不正常的部分切除。修复对保护 DNA 的正常功能是非常重要的。的正常功能是非常重要的。n修复作用包括修复作用包括光诱导的修复（光修复）光诱导的修复（光修复）和和 不依赖光的修复（暗修复），在高等不依赖光的修复（暗修复），在高等动物体内暗修复代替了光修复。动物体内暗修复代替了光修复。（1）
20、光修复）光修复 光修复也称光复活，它是由可见光（光修复也称光复活，它是由可见光（300nm-400nm）激活激活 光复活酶光复活酶，该酶能分解胸腺嘧啶二，该酶能分解胸腺嘧啶二聚体。聚体。已从细菌和一些动物的细胞中分裂出一种光复已从细菌和一些动物的细胞中分裂出一种光复活酶活酶。此酶与此酶与DNA形成的复合物以一种尚未了解形成的复合物以一种尚未了解的方式吸收光，并利用光能裂解二聚体中的环丁的方式吸收光，并利用光能裂解二聚体中的环丁基的基的C-C键，以达到复活胸腺嘧啶。哺乳动物和人键，以达到复活胸腺嘧啶。哺乳动物和人体内缺乏此酶。体内缺乏此酶。（2）暗修复）暗修复:暗修复通过三种不同的机理来完成修复
21、：暗修复通过三种不同的机理来完成修复：（1）切除修复（）切除修复（excison repair）（2）重组修复（重组修复（recombinational repair）（3）SOS 修复（修复（SOS repair）（1）切除修复）切除修复（2）重组修复）重组修复 重组修复是一种复制重组修复是一种复制后修复。后修复。重组修复的结果是重组修复的结果是亲亲代链上的嘧啶二聚体并未代链上的嘧啶二聚体并未消除，但这一条消除，但这一条 DNA 链链却逐渐被稀释，最后对正却逐渐被稀释，最后对正常生理过程没有影响，损常生理过程没有影响，损伤也就得到了修复。伤也就得到了修复。（3）SOS修复修复 这种修复是允许
22、子链这种修复是允许子链 DNA 复制合成时越过复制合成时越过亲链上受损伤的片段而不形成缺口，这种修复以亲链上受损伤的片段而不形成缺口，这种修复以牺牲复制的忠实性为代价。牺牲复制的忠实性为代价。10.5 以以RNA为模板合成为模板合成DNA的过程的过程n20 世纪世纪 70 年代从一些含年代从一些含 RNA 的肿的肿瘤病毒如瘤病毒如 鸟类成髓细胞白血病病毒鸟类成髓细胞白血病病毒 和和 劳氏肉瘤病毒劳氏肉瘤病毒 中分离到一种独特中分离到一种独特的的 RNA 指导的指导的 RNA 聚合酶聚合酶（RNA-directed DNA polymerase），），由于它以由于它以 RNA 为模板合成为模板合
23、成 DNA，故此称为反转录酶（故此称为反转录酶（reverse transcriptase）。）。反转录酶：反转录酶：反转录酶以反转录酶以 病毒病毒 RNA 为模板，在引物参与下以四种为模板，在引物参与下以四种 dNTP 为底物像为底物像 DNA 聚合酶一样，按聚合酶一样，按 5 3 方向催化合成方向催化合成一条与模板一条与模板 RNA 互补互补 DNA 链，形成链，形成 RNA-DNA 杂交链，其杂交链，其中的中的 DNA链称为互补链称为互补 DNA 链链（cDNA）。这时这时 RNA 被降被降解解，然后再以新合成的，然后再以新合成的 DNA 链为模板，合成另一条互补的链为模板，合成另一条互
24、补的 DNA 链，形成双链的链，形成双链的 DNA 分子。分子。新合成的双链新合成的双链 DNA 分子可以进入宿主细胞核，并整合到分子可以进入宿主细胞核，并整合到宿主的宿主的 DNA 中，随宿主中，随宿主 DNA 一起复制传递给子代细胞。在一起复制传递给子代细胞。在某些条件下此潜伏的某些条件下此潜伏的 DNA 可以活跃起来转录出病毒可以活跃起来转录出病毒 RNA 而而使病毒繁殖。在另外一些条件下它也可以引起宿主细胞发生使病毒繁殖。在另外一些条件下它也可以引起宿主细胞发生癌变。癌变。PCR 2 0世纪世纪 80 年代末发展起来的一种的年代末发展起来的一种的 DNA 特定片段体外快速合成扩增特定片
25、段体外快速合成扩增 的方的方法法。称。称 多聚酶多聚酶链式反应链式反应（PCR，Polymerase chain reaction）PCR 反应的步骤反应的步骤:在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，人工合成的两个人工合成的两个 DNA 引物，四种脱氧单核苷酸（引物，四种脱氧单核苷酸（dNTP），），一种耐热的多聚酶一种耐热的多聚酶 和和 Mg 2+。高温变性：高温变性：将上述溶液加热，使模板将上述溶液加热，使模板 DNA 在高温下变性，在高温下变性，双链解开为两条单链（如双链解开为两条单链（如 95）；）；低温退火：低温退火：然后降低反应温度，使两条引物在低温下分别与然后降低反应温度，使两条引物在低温下分别与两条模板互补退火，形成局部双链（两条模板互补退火，形成局部双链（37-65 ）；）；中温延伸：中温延伸：再升高反应温度至中温（再升高反应温度至中温（72），此时多聚酶以），此时多聚酶以 dNTP 为原料，以两引物为复制的起点，在两条模板上合成为原料，以两引物为复制的起点，在两条模板上合成新的新的 DNA 子链。子链。如此重复改变反应温度，即如此重复改变反应温度，即高温变性高温变性、低温退火低温退火和和中温延伸中温延伸三个阶段，三个阶段，DNA 片段几何级数扩增下去。片段几何级数扩增下去。