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1、第四章第四章 离心技术离心技术一、一、基本原理基本原理 生生物物样样品品悬悬浮浮液液在在高高速速旋旋转转下下，由由于于巨巨大大的的离离心心力力作作用用，使使悬悬浮浮的的微微小小颗颗粒粒以以一一定定的的速速度度沉沉降降，从从而而与与溶溶液液得得以以分分离离，而而沉沉降降速速度度取取决决于于颗颗粒粒的的质质量、大小和密度。量、大小和密度。离心技术离心技术概念概念离心力离心力 F=ma=mF=ma=m2 2 r r相相对对离离心心力力（RCFRCF）：在在离离心心场场中中，作作用用于于颗颗粒粒的的离离心心力相当于地球重力的倍数，单位是力相当于地球重力的倍数，单位是“g”g”低低速速离离心心时时常常以
2、以转转速速“rpmrpm”来来表表示示，高高速速时时以以“g g”表示。表示。RCF=1.11910 RCF=1.119105 5(rpm)(rpm)2 2 r r沉降系数沉降系数(S)(S)：单位离心力场中粒子沉降的速度，秒。单位离心力场中粒子沉降的速度，秒。1 1S=10S=101313s s，用用S S可以近似表示分子量可以近似表示分子量 。沉降系数沉降系数(S)(S)n S S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时间。态到达等速运动所经过的时间。n对一定的样品，在一定的介质中，样品沉降系对一定的样品，在一定的介质中，样品沉降
3、系数数S S也常保持不变。也常保持不变。n典型的典型的S S值一般在值一般在10101313s s，所以该数值命名为所以该数值命名为1 1即即1 1S=10S=101313s sn SvedbergSvedberg单位，简写为单位，简写为S S，纪念离心机研究先纪念离心机研究先锋锋SvedbergSvedberg。常用沉降系数以描述某些生物大常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。分子或亚细胞器大小。nS S值随颗粒质量的增加而增加，但非线性关系值随颗粒质量的增加而增加，但非线性关系二、离心机的主要类型二、离心机的主要类型制备性离心机：制备性离心机：主要用于分离各种生物材料，主要用于分
4、离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大。每次分离的样品容量比较大。分析性离心机：分析性离心机：一般都带有光学系统，主要用一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为，能依据待测物质在离心场中的行为，能推断物推断物质的纯度质的纯度、形状和分子量等。、形状和分子量等。离心技术离心技术 制备性离心机可分为三类：制备性离心机可分为三类：普普通通离离心心机机：最最大大转转速速6000 6000 rpmrpm左左右右，室室温温下下操操作作。分分离离形形式式是是固固液液沉沉降降分分离离，用用于于收收集集易易沉沉降降的的大
5、大颗颗粒物质。粒物质。高高 速速 冷冷 冻冻 离离 心心 机机：最最 大大 转转 速速 为为 20000200002500025000rpmrpm（r/minr/min），分分离离形形式式也也是是固固液液沉沉降降分分离离，一一般般都都有有制制冷冷系系统统，用用于于微微生生物物菌菌体体、细细胞胞碎碎片片、大大细细胞胞器器、硫硫酸酸铵铵沉沉淀淀和和免免疫疫沉沉淀淀物物等等的的分分离离纯纯化化工作。工作。离心机的主要类型离心机的主要类型离心技术离心技术 超速离心机超速离心机：转速可达转速可达500005000080000 80000 rpmrpm，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分分离的形式是
6、差速沉降分离和密度梯度区带分离，可使亚细胞器得到分级分离，还可以分离离，可使亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。病毒、核酸、蛋白质和多糖等。超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别机的主要区别 转子转子主要有四种主要有四种 角式转子角式转子：较大的容量，且重心低，运转平较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长。但出现衡，寿命较长。但出现“壁效应壁效应”。荡平式转子荡平式转子：有利于离心结束后由管内分层有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带，但所需时间长取出已分离的各样品带，但所需时间长 。区带转子区带转子：分离
7、效果好，但耐腐蚀要求高，分离效果好，但耐腐蚀要求高，操作复杂操作复杂 。垂直转子垂直转子：离心所需时间短，但降速慢。离心所需时间短，但降速慢。三、离心机的主要构造三、离心机的主要构造离心技术离心技术 离心管离心管：离心管主要用塑料和不锈钢制成：离心管主要用塑料和不锈钢制成n离心前管盖必须盖严离心前管盖必须盖严，管盖有三种作用：管盖有三种作用：防止样品外泄。防止样品外泄。防止样品挥发。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。支持离心管，防止离心管变形。离心机的主要构造和类型离心机的主要构造和类型离心技术离心技术 v将样品中将样品中不同沉降系数不同沉降系数或浮力密度差或浮力密度差的物质分开。的物
8、质分开。四、制备性超离心技术四、制备性超离心技术 制备性超速离心的分离方法 1、差速沉降离心法：、差速沉降离心法：n采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使进行离心，使沉降速度沉降速度不同的颗粒，在不不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。的方法。离心技术离心技术1 1、差速沉降离心法：、差速沉降离心法：n用于分离沉降系数相差较大的用于分离沉降系数相差较大的颗粒和颗粒和粗制品提取。粗制品提取。n优点：操作简易，可使用容量优点：操作简易，可使用容量较大的角转子。较大的角转子。n缺点：分离效果差，沉
9、淀于管缺点：分离效果差，沉淀于管底的颗粒容易变性失活。底的颗粒容易变性失活。离心技术离心技术已破碎的细胞已破碎的细胞 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核）上清液上清液 沉淀（细胞膜碎片、沉淀（细胞膜碎片、线粒体、溶酶体）线粒体、溶酶体）上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白体）沉淀（核糖核蛋白体）上清液（可上清液（可溶性组分）溶性组分）500g,1010 000g,10100 000g,3h 2.密度梯度区带离心法（区带离心法）：密度梯度区带离心法（区带离心法）：n将样品加在将样品加在惰性梯度介质惰性梯度介质（蔗糖或氯化铯（蔗糖或氯化铯等）等）中进行离心沉降或沉降平衡，在一定中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的
10、离心力下把颗粒的离心力下把颗粒分配到梯度分配到梯度中某些特定中某些特定位置上，形成位置上，形成不同区带不同区带的分离方法。的分离方法。制备性超速离心的分离方法n优点：优点：分离效果好；分离效果好；适应范围广；适应范围广；能保持颗粒活性。能保持颗粒活性。n缺点：缺点：离心时间较长；离心时间较长；需要制备惰性梯度介质溶液；需要制备惰性梯度介质溶液；操作严格，不易掌握。操作严格，不易掌握。区带离心法分为两种：区带离心法分为两种：（1）差速区带离心法）差速区带离心法 （2）等密度区带离心法）等密度区带离心法 离心技术离心技术（1）差速区带离心法：）差速区带离心法：n当不同的颗粒间存在当不同的颗粒间存在
11、沉降速沉降速度差度差时，在一定的离心力作时，在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法。不同区域上形成区带的方法。n用于分离用于分离有一定沉降系数差有一定沉降系数差的颗粒或分子量相差的颗粒或分子量相差3 3倍的倍的蛋白质。蛋白质。区带离心法区带离心法差速区带离心法差速区带离心法n离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束；前结束；n样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液梯度介质通常用蔗糖溶液 n介质梯度应预先形成介
12、质梯度应预先形成（2）等密度区带离心法：）等密度区带离心法：n离离心心管管中中预预先先放放置置好好梯梯度度介介质质，样样品品加加在在梯梯度度液液面面上上，或或样样品品预预先先与与梯梯度度介介质质溶溶液液混混合合后装入离心管，通过离心后装入离心管，通过离心形成梯度形成梯度。n离离心心时时，样样品品的的不不同同颗颗粒粒向向上上浮浮起起，一一直直移移动动到到与与它它们们的的密密度度相相等等的的等等密密度度点点的的特特定定梯梯度度位位置置上上，形形成成几几条条不不同同的的区区带带，这这就就是是等等密度区带离心法。密度区带离心法。n此法常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。此法常用来分离提取核酸、亚细胞器
13、和质粒。区带离心法区带离心法问题：n等密度区带离心法等密度区带离心法体系到达平衡状态后，体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速有无意义？再延长离心时间和提高转速有无意义？n处于等密度点上的样品颗粒的区带形状处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置是否受离心时间所影响？和位置是否受离心时间所影响？n提高转速可以缩短达到平衡的时间，离提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。数日。3、收集区带的方法、收集区带的方法1 1、穿刺法、穿刺法2 2、虹吸法、虹吸法3 3、切割法、切割法4 4、取代法、取代法浓浓取取代代液液收集收集通入空气、轻液体通入空气、轻液体收集收集4、梯度的分析、梯度的分析 紫外吸收法、紫外吸收法、酶活力测定法、酶活力测定法、放射标记法、放射标记法、免疫法、免疫法、电泳法等电泳法等 四、离心操作的注意事项：