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1、小动物活体成像 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望概述 动物活体成像技术是指应用影像学方法,对活 体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的 定性和定量研究。动物活体成像技术主要分为：可见光成像(optical imaging)核素成像(PETPSPECT)核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)计算机断层摄影(computed tomography,CT)成像 超声(ultrasound)成像可见光成像体内可见光
2、成像包括生物发光与荧光两种技术。生物发光技术是用荧光素酶基因标记DNA，利用其产生的蛋白酶与相应的底物发生生化反应，产生生物体内的光信号。荧光技术则采用荧光报告基因(GFP、RFP)或荧光染料(包括荧光量子点等新型纳米标记材料)进行标记,利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光,就可以形成体内的生物光源。生物发光哺乳动物生物发光，是将荧光素酶基因整合到细胞的基因组DNA 上，产生稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达。萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶海肾荧光素酶海肾荧光素酶底物：荧光素腔肠素发射波长：540 600 nm460 540 nm
3、体内的代谢较慢，而且特异性好活体生物发光成像技术应用1.肿瘤学肿瘤学 直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到。上图：肿瘤的长期检测，分别是7d、14d、21d成像2.药物研究药物研究荧光素酶癌症模型可用于癌症体内用药在整体动物水平上进行长期疗效跟踪观察。利用无创伤活体成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞的变化进行实时观测和评估。利用活体成像技术高灵敏度、观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同剂量，不同给药时间、不同给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、
4、给药剂量及给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。3.基因治疗基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。目前，基因治疗主要是以病毒做载体，可应用荧光素酶基因作为报告基因加入载体，观察目的基因是否到达动物体内的特异组织和是否持续高效表达，这种非侵入方式具有低毒性及免疫反应轻微等优点且可以直接实时观察，了解病毒或载体侵染的部位和时域信息。4.干细胞及免疫学干细胞及免疫学用荧光素酶标记干细胞有两种方法：一种是标记组成性表达的基因，做成转基因动物，干细胞就被标记了，若干细胞移植到另外动物体内，可以用活体生物发光成像技术示踪干细胞
5、在体内的增殖、分化及迁徙的过程；另外一种方法是用慢病毒直接标记干细胞后，移植到体内观测其增殖、分化及迁徙过程，研究其修复、治疗损伤或缺陷部分的效果，进一步探讨其机制。标记免疫细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞等的识别和杀死功能，评价免疫细胞的免疫特异性、增殖、迁移及功能等。5.基因表达模式与基因功能研究基因表达模式与基因功能研究为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型，观察目的基因的表达模式。6.蛋白质相互作用蛋白质相互作用原理是将分开时都不单独发光的荧光酶的C 端和N 端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个
6、蛋白质之间有相互作用，荧光酶的C 端和N 端就会被连接到一起，激活荧光素酶的转录表达，在有底物存在时出现生物发光。7.细胞凋亡细胞凋亡原理是用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素)，但在其连接处加上caspase(细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点。细胞发生凋亡时，表达caspase，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光素酶开始发光。8.疾病机理疾病机理可以标记与某种疾病密切相关的基因，做成转基因小鼠，通过特定的药物作用或其他条件下该基因表达的变化，来推测该疾病的发病机理和药物对疾病治疗的效果等。荧光成像荧光技术则采用绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白RFP)等荧光报告
7、基因和FITC、Cy5、Cy7 等荧光素及量子点(quantum dot，QD)进行标记，利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。红光的穿透性在体内比蓝 绿光的穿透性效率高，近 红外荧光（700-800nm）避开了生物个体在可见荧 光区的本底信号，是成像 观察的最佳选择。活体动物荧光成像技术应用活体动物荧光成像技术应用1.肿瘤学 活体荧光成像技术能够无创伤定量检测小鼠的皮下瘤模型。相对于生物发光成像技术，活体荧光成像技术检测时间较快，只需要不到1s的时间，同时不需要注射底物，节约了检测成本。左图：通过H-460-GFP皮下肿瘤模型，建立小鼠肺癌的
8、实验模型，可用来进行有关抗癌药物的筛选（图1）。可用于测量皮下肿瘤的生长和监测对潜在化学治疗药物的反应。2.抗体分子探针的一端联有能够和生物体内特异靶点结合的分子结构（如肽类、酶的底物、配体等），另一端则是荧光染料。左图：通过Cy5.5 标记的抗体的体内代谢实验，可见肝、肾等处的分布。3.药学研究荧光成像在药物制剂学研究，尤其是药物靶向性研究，药物载体研究中有巨大优势。有关专家正在设计用合适的荧光染料标记小分子药物，观察药物在动物体内的特异性分布和代谢情况。左图：应用NIR 荧光染料标记的 淀粉酶来观察治疗Alzheimer 病的药物的治疗效果。4.组织工程通过EGFP标记的组织工程细胞移植到
9、小鼠体内特制的支架上，观察该细胞的生长和变化，从而判断组织工程的成败与否。生物发光及荧光特点的比较优优 点点缺点缺点生物发光生物发光1.特异性强，无自发荧光2.高灵敏度，在体内可检测到几百个细胞3.检测的深度在3-4厘米4.精确定量1.信号较弱，检测时间较长，需要灵敏的CCD镜头，仪器精密度2.要求高，需要注入荧光素，实验成本高3.细胞或基因需要转基因标记4.有些物质不能用生物发光标记，如抗体、多肽等 很难用于人体 荧光成像荧光成像1.荧光染料、蛋白标记能力强，多种蛋白及染料可用于多重标记，信号强度大，成像速度快2.实验成本低3.活体动物、动物尸体、器官全部可以进行成像4.可衔接体内实验和体外
10、实验，保持研究的连贯性，未来可能用于人体 1.非特异性荧光限制了灵敏度，体内检测最低约105细胞2.检测深度受限制 较难精确体内定量 靶向型肿瘤探针2-DG Optical Probe：肿瘤细胞的糖酵解活动较为旺盛，2-deoxy-D-glucose(2-DG)是一种葡萄糖类似物，可掺入糖酵解途径与葡萄糖形成底物竞争，IRDye 800CW标记的2-DG探针可以示踪由A431、SW620、3T3-L1和PC3LMN4等细胞系衍生而来的移植肿瘤。上图：以10nmol的注射量示踪由A431细胞系衍生的移植肿瘤。靶向型肿瘤探针EGF Optical Probe：上皮细胞生长因子受体(EGFR)隶属于
11、酪氨酸激酶受体家族，是上皮细胞的膜表面受体，多数肿瘤细胞均过表达EGFR，如头颈部肿瘤（80-100%）、肾细胞癌（50-90%）、肺癌（40-80%）、神经胶质瘤（40-50%）、卵巢癌（35-70%）、膀胱癌（31-48%）、胰腺癌（30-50%）、结肠癌（25-77%）、乳腺癌（14-91%）。该类探针是应用得最为广泛地特异性监控实体瘤生长状况的探针。靶向型肿瘤探针RGD Optical Probe：多数肿瘤细胞的表面过表达整联蛋白/整合素，该蛋白介导细胞-细胞、细胞-细胞基质之间的相互作用，整联蛋白受体v3特异性识别RGD(Arg-Gly-Asp)模体结构域。该类探针即为IRDye 6
12、80RG或IRDye 800CW标记的RGD三肽，用于特异性示踪过表达v3 受体的肿瘤细胞。左图：1nmol IRDyr 800CW RGD Probe的注射量24h后迚行观察，可见左臀的U87细胞肿瘤和右臀的A431细胞肿瘤。靶向型肿瘤探针PEG Contrast Agent：肿瘤细胞的血管具有增强渗透性和滞留性(Enhanced Permeability and Retetion,EPR)，肿瘤微环境中的血管内壁通常是不连续性的，使得分子能够向邻近的组织扩散；此外，这些区域内的淋巴排毒作用较弱，使得大分子在此积累。IRDye 800CW PEG(25-60 kDa)是非特异性示踪试剂，积累
13、在肿瘤生长部位的淋巴处，以此来失踪肿瘤，也可作为淋巴的示踪剂。左图：注射1nmol探针4h后，可见肿瘤不其周围的血管。靶向型探针Cell Labeling：荧光基团标记的脂肪族烃长链，通过疏水作用插入细胞的磷脂双分子层，不可逆性地标记细胞，且不影响细胞正常的生理活动，用于示踪特定细胞克隆群在小动物体内的迁移生长。上图：示踪定位于肺毛细管床的移植细胞。靶向型探针PSVue 794 Reagent：PSVue 794探针用于检测凋亡中和已坏死细胞、细菌细胞壁和其它负电荷膜结构，激发波长为794nm，发射波长为810nm。该探针不带负电荷的膜和不同肿瘤的坏死区域强烈结合，此外，还与凋亡或坏死细胞膜所
14、暴露出磷脂酰丝氨酸残基结合。A.健康小鼠对照；B.脑组织坏死小鼠。Carbon Dots for Optical Imaging in vivoJ Am Chem Soc.2009 August 19图：皮下注射碳量子点。b.c.470 nm excitation and 525 nm emission filtersd.e.545nm excitation and 620 nm emission filters图：在脚趾末端注射碳量子点，追踪碳点在淋巴管中的移动。a.b.c 碳量子点向腋淋巴结移动，24h 后解剖可以观察到碳量子点在淋巴结里的分布。图：静脉注射碳量子点。a.b.c.3h只有在
15、膀胱和尿液中检测到荧光;a.b.c.4h 后解剖发现在肾和肝脏里检测到荧光Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living miceNature Nanotechnology,2008 September上图：纳米管RGD 连接示意图。RGD 让纳米管与肿瘤细胞的整合素相连上图：SWNT-RGD 靶向肿瘤。上图：SWNT-RGD 靶向肿瘤。a,Fluorescence image(red)of a mouse injected with QDRGD.b,Tumor photograph.c,Horizontal(xy plane)and d,vertical(xz plane)slices in the 3D photoacoustic image of a mouse injected with SWNTRGD.谢谢！谢谢！