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1、动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基一、一、培养基的基本要求培养基的基本要求营养成分营养成分促生长因子促生长因子激素激素渗透压渗透压pH无毒、无污染无毒、无污染一、一、培养基的基本要求培养基的基本要求1、营养成分、营养成分 氨基酸：氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。氨基酸：氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所所以细胞都需要以细胞都需要12种必须氨基酸（种必须氨基酸（缬、亮、异亮、缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、络、精、胱苏、赖、色、苯丙、蛋、组、络、精、胱）。）。此外还需要此外还需要谷氨酰胺谷氨酰胺，他在细胞代谢过程中有，他在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶
2、合成重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。需要的基本物质。单糖：单糖：培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。吸收能力最高，半乳糖最低。维生素维生素：主要是：主要是辅酶、辅基辅酶、辅基，必不可少。，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄
3、素、硫胺素、维生素核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基都是培养基常有的成分。常有的成分。无机离子与微量元素无机离子与微量元素：细胞生长除需要：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素，钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、铜、锰、还需要微量元素，如铁、锌、铜、锰、钼、钒等。钼、钒等。2、促生长因子及激素、促生长因子及激素各种激素、生长因子的功能各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化）保持细胞的状态（分化或未分化）有些激素有些激素对许多细胞生长有促生长作用对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨如
4、胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。基酸。有些激素有些激素对某一类细胞有明显促进作用对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。3、渗透压、渗透压细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压人血浆渗透压290mOsm/kg，可视为培养，可视为培养人体细胞的理想渗透压。人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。左右。大多数哺乳动物细胞，渗透压在大
5、多数哺乳动物细胞，渗透压在260-320mOsm/kg的范围都适宜。的范围都适宜。4、pH大多数细胞适宜大多数细胞适宜pH为为培养基应具备一定的缓冲能力培养基应具备一定的缓冲能力 造成造成pH波动主要是代谢产生的波动主要是代谢产生的CO2，在封，在封闭式培养过程中闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培与水结合产生碳酸，培养基养基pH很快下降。很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，通过稳定调节温缓冲系统，通过稳定调节温箱中箱中CO2浓度（浓度（5%），使之与培养基中的），使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。处于平衡状态
6、。5、无毒、无污染、无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力，因此培养基应达到：有任何抵抗能力，因此培养基应达到：无化学物质污染无化学物质污染 无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）抗体、补体）对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制
7、过程，配制对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。除菌。二、天然培养基二、天然培养基天然培养基：天然培养基：血清的种类血清的种类 血清的主要成分和作用血清的主要成分和作用 血清的质量标准血清的质量标准 血清的外观血清的外观 血清的使用与储存血清的使用与储存 使用血清的优缺点使用血清的优缺点天然培养基：指来自动物体液或利用组织天然培养基：指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基。分离提取的一类培养基。如血浆、血清、如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。淋巴液、鸡胚浸出液等。但是由于天然培养基制作过程复
8、杂、批间但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的培养基是血清，另外各种目前广泛使用的培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞液是必不可少的。在培养某些特殊细胞液是必不可少的。血清的种类：血清的种类：小牛血清小牛血清 取自出生取自出生10-30天的小牛天的小牛 新牛血清新牛血清 取自出生取自出生24小时之内的新生小时之内的新生 胎牛血清胎牛血清 取自剖腹产的胎牛，血清中取自剖腹产的胎牛，血清中 所所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。含的抗体
9、、补体等对细胞有害的成分最少。血清的主要成分和作用血清的主要成分和作用主要成分主要成分 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。生长因子、激素、无机物等。主要作用主要作用 提供基本营养物质提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白提供结合蛋白 对培养中的细胞起到某些保护作用对培养中的细胞起到某些保护作用血清的质量标准血清的质量标准血清质量高低取决于两方面因素：血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，一是取材对
10、象，二是取材过程。二是取材过程。理化性质：理化性质：渗透压、渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白值、蛋白电泳图谱、蛋白 含量、含量、激素水平、内毒素等。激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于不低于35-45g/L）、球蛋白含量（）、球蛋白含量（应小于应小于20g/L）、血红蛋）、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。微生物检测微生物检测包括细菌、真
11、菌、支原体、病毒等。特别包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测。是对支原体、病毒的检测。支原体是一种很小的微生物，可通过孔径支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22m的滤膜。支原体、病毒污染在光学显的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。会影响实验结果。检测支原体的方法很多，如培养法、检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。法、荧光染色法、电镜观察法等。血清的质量标准血清的质量标准促生长效果促生长效果 是血清重要的特性之一，应以是血清重要的特性之一，应以培养的细胞来检
12、测培养的细胞来检测 克隆形成率克隆形成率：悬浮生长的细胞，有限稀释法：悬浮生长的细胞，有限稀释法，统计克隆生长百分比。，统计克隆生长百分比。贴瓶率测定贴瓶率测定：贴壁细胞，集落数占接种细：贴壁细胞，集落数占接种细胞数的百分比。胞数的百分比。续传代培养续传代培养：细胞培养七天收集细胞，计：细胞培养七天收集细胞，计数，取平均值。连续测试三个周期以上，数，取平均值。连续测试三个周期以上，观察细胞生长状况。观察细胞生长状况。血清的外观血清的外观好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。如血清浑浊、不透明、含许
13、多沉淀物，如血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性。说明血清污染或血清中的蛋白质变性。若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象。白含量太高，取材时有溶血现象。摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。的生理盐水太多。血清的使用与储存血清的使用与储存使用前处理：使用前处理：灭活处理，即灭活处理，即5630分钟。灭分钟。灭活的目的使去除血清中的补体成分。活的目的使去除血清中的补体成分。储存条件：储存条件：血清一般储存在血清一般储存在-20，同时应，同时应避免反复冻融。使用前融
14、化，融化时最好先避免反复冻融。使用前融化，融化时最好先置于置于4，融化后的血清在，融化后的血清在4 不宜长时间不宜长时间存放，应尽快使用。存放，应尽快使用。使用浓度：使用浓度：自从有了合成培养基，血清就是自从有了合成培养基，血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用，作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为使用浓度一般为5-20%，最常用是，最常用是10%。使用血清的优缺点使用血清的优缺点牛血清的优点牛血清的优点 来源充足来源充足 制备技术成熟制备技术成熟 经过长时间的应用有比较深入的理解经过长时间的应用有比较深入的理解细胞培养中使用血清的缺点细胞培养中使用血清的缺点 改变某种细
15、胞在体内的正常状态改变某种细胞在体内的正常状态 含有一些对细胞会产生毒素的物质含有一些对细胞会产生毒素的物质 每批血清都有差别，其成分不能保持一致每批血清都有差别，其成分不能保持一致 取材过程有可能带入支原体、病毒取材过程有可能带入支原体、病毒三、合成培养基三、合成培养基 如何选择培养基如何选择培养基 培养基的配制培养基的配制 无血清培养基无血清培养基 无蛋白培养基无蛋白培养基 限定化学成分培养基限定化学成分培养基 三、合成培养基三、合成培养基基本培养基种类基本培养基种类如何选择培养基如何选择培养基培养基的配制培养基的配制无血清培养基无血清培养基即不需要添加血清就可以维持细胞在体外即不需要添加
16、血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。较长时间生长繁殖的合成培养基。如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用，而时需要排除其他生长因子的干扰作用，而血清中可能含有各种生长因子；血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得他们的要大规模的培养某种细胞，以获得他们的分泌产物。分泌产物。无血清培养基的基本配方无血清培养基的基本配方基础培养液以基础培养液以Ha
17、mF12和和DMEM最为常用，最为常用，一般两者以一般两者以1：1混合。混合。添加组分包括以下几大类物质：添加组分包括以下几大类物质：促贴壁物质：促贴壁物质：贴壁细胞，无血清培养基中一贴壁细胞，无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子。定要添加促贴壁和扩展因子。促生长因子及激素：促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。必不可少的，如胰岛素。酶抑制剂：酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用培养贴壁生长的细胞，
18、需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的，最常用的是大豆胰达到保护细胞的目的，最常用的是大豆胰酶抑制剂。酶抑制剂。结合蛋白和转运蛋白：结合蛋白和转运蛋白：转铁蛋白和牛血清转铁蛋白和牛血清蛋白。牛血清蛋白的添加比较大，可增加蛋白。牛血清蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。血清白蛋白。微量元素：微量元素：硒是最常见的。硒是最常见的
19、。无蛋白培养无蛋白培养即不含有动物蛋白的培养基。即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素，转铁蛋白、牛血清蛋白等。许多利用岛素，转铁蛋白、牛血清蛋白等。许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果生长过程中使用了含有动物蛋白质体，如果生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂。的培养基，纯化过程就比较复杂。许多无蛋白培养基添加了许多无蛋白培养基添加了植物水解物植物水解物以替代以替代动物激素、生长因子的作用。目前已经有适动物激素、生长因子的作用。目前已经有适合于合于C
20、HO细胞生长的细胞生长的PFM，PFM只适合于只适合于悬浮生长的细胞。悬浮生长的细胞。限定化学成分培养基（限定化学成分培养基（CDM）培养基中的所有成分都是明确的。培养基中的所有成分都是明确的。它不含有动物蛋白，也不添加植物水解物，它不含有动物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。化合物，如短肽、植物激素等。有利于分析细胞的分泌产物，目前已经有有利于分析细胞的分泌产物，目前已经有适合于适合于293细胞、细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生细胞、杂交瘤细胞生长的长的CDM，CDM只适合于悬浮生长的细只适合于悬浮生长
21、的细胞。胞。四、其他培养用液四、其他培养用液平衡盐溶液平衡盐溶液消化液消化液pH调整液调整液平衡盐溶液（平衡盐溶液（BSS）组成组成：主要由无机盐、葡萄糖组成：主要由无机盐、葡萄糖组成作用作用：维持细胞渗透压平衡，保持：维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定稳定及提供简单的营养及提供简单的营养用途用途：用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂：用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂。洗、配制其他试剂。配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有钙离子、镁离子，应当先溶解果配方中含有钙离子、镁离子，应当先溶解这些成分，配好的平衡盐溶液可以过滤除菌这些成分，配好的平
22、衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。或高温灭菌。消化液消化液用途：用途：取材进行原代培养时需要将组织块消化解取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时也需要将贴壁细胞离形成细胞悬液；传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。从瓶壁上消化下来。胰酶溶液胰酶溶液 胰酶的活性可以用消化酪蛋白的能力表示，常胰酶的活性可以用消化酪蛋白的能力表示，常见见1:125和和1:250 组织培养用的胰酶溶液一般配制成组织培养用的胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%的的浓度，配制时要用不含钙离子和镁离子及血清的浓度，配制时要用不含钙离子和镁离子及血清的平衡盐溶液。平衡盐溶液。胰酶作用及溶解的最佳胰
23、酶作用及溶解的最佳pH8-9，配制胰酶溶液，配制胰酶溶液应将液体调整应将液体调整pH8.过滤除菌。过滤除菌。消化液消化液EDTA溶液：用了解离细胞，主要是破坏溶液：用了解离细胞，主要是破坏细胞间的连接。细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进和胰酶的混合液进行消化。行消化。EDTA使用浓度为使用浓度为0.02%，配制时应加碱助，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。菌。胶原酶溶液胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对
24、象是胶原组织，使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为或胶原酶的使用浓度为或200000U/L，作，作用的最佳胶原酶不受钙离子、镁离子及用的最佳胶原酶不受钙离子、镁离子及血清的抑制，配制时可以血清的抑制，配制时可以PBS。pH调整液调整液抗生素抗生素五、培养物的污染及防止五、培养物的污染及防止细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测常见的污染细菌有大肠杆菌、假单胞菌、常见的污染细菌有大肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等。葡萄球菌等。细菌污染初期由于双抗作用，污染情况用细菌污染初期由于双抗作用，污染情况
25、用倒置显微镜观察不易判断。倒置显微镜观察不易判断。被污染液大多可改变被污染液大多可改变pH,使培养液变浑浊、使培养液变浑浊、变色。变色。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。真菌污染对细胞的影响及污染物的检测真菌污染对细胞的影响及污染物的检测被污染后易于发现，被污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞间。念珠菌和酵状，纵横交错穿行于细胞间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之
26、间生母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。支原体污染对细胞影响及污染物的检测支原体污染对细胞影响及污染物的检测支原体是介于细菌和病毒之间、能独立生支原体是介于细菌和病毒之间、能独立生活的最小微生物，无细胞壁，形态呈多形，活的最小微生物，无细胞壁，形态呈多形，最小可以通过过滤器。常在购买各种血清最小可以通过过滤器。常在购买各种血清中含有支原体。中含有支原体。被他污染后，他们不会使细胞死亡可以与被他污染后，他们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，细胞无明显变化，实则细细胞长期共存，细胞无明显变化，实则细胞受到多方面潜在影响，如胞受到多方面潜在影响，如引起细胞变形，引起细胞变形，影响影响DNA合成，抑制细胞生长。合成，抑制细胞生长。用用卡拉霉素卡拉霉素预防支原体污染有效。预防支原体污染有效。污染的排除污染的排除抗生素排除法抗生素排除法加温除菌加温除菌动物体内接种动物体内接种与巨噬细胞共同培养与巨噬细胞共同培养维生素功能