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1、PCR技术的应用分子克隆操作的一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。一、概述一、概述 PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成合成 酶和四种脱氧核糖核酶和四种脱氧核糖核酸进行酸进行DNA的体外合成反应。的体外合成反应。PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获技术具有灵敏度高，特异性
2、高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。得多达几百万拷贝的目的基因。该技术在上个世纪该技术在上个世纪80年代中期由美国年代中期由美国发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，术，在很多领域中广泛使用，也因此获得也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。年度的诺贝尔化学奖。二、二、PCR基本原理基本原理 DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 DNA聚合酶、聚合酶、DNA连接酶、引发酶、连接酶、引发酶、RNA引物、四种
3、脱氧核糖核酸、引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境等超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。多成份参与的过程。PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个复制，所以在一个PCR中必中必需成分是需成分是 1.模板模板DNA 2.DNA聚合酶聚合酶 3.四种脱氧核糖核酸四种脱氧核糖核酸 4.正向和反向两条引物正向和反向两条引物 5.适当的缓冲体系。适当的缓冲体系。模板序列：待扩增的模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链的序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋可包括线形双螺旋DNA，如基，如基因组因组DNA，及闭环双链，及
4、闭环双链DNA，如质粒；，如质粒；模板的来源很广，如从细胞模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组细菌中提取基因组DNA、提取、提取mRNA经反转录得到经反转录得到cDNA、质粒、病毒等；、质粒、病毒等；每个反应中模板的量为每个反应中模板的量为1 ng1 g。质粒。质粒DNA和纯化的和纯化的DNA的量可少一些，而基的量可少一些，而基因组因组DNA的量应多一些。的量应多一些。PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致PCR的非特异性扩增。的非特异性扩增。1、模板、模板DNA引物（引物（primer）也称
5、为寡核苷酸引物，常规的）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为反应需要两种引物，分别成为5端引端引物和物和3端引物，或称为正向引物和反向引物。端引物，或称为正向引物和反向引物。通常通常DNA及及mRNA序列的写法为序列的写法为53，所以，所以5端引物与目的序列的端引物与目的序列的5末端序列相同，而末端序列相同，而3端引物与目的序列的端引物与目的序列的3末端序列反向互补。末端序列反向互补。2、引物、引物它们作为它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。序列的长度。为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有为了保证扩
6、增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有1518 bp。55335533上游引物上游引物下游引物下游引物DNA聚合酶：以聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。的一种酶。早期的早期的PCR反应使用的反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段。但该酶在高温片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。随着新的耐热随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使反应中的应用，
7、使PCR操作更方便，产量更稳定。操作更方便，产量更稳定。目前商品化的目前商品化的DNA聚合酶有聚合酶有Taq DNA聚合酶和聚合酶和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。Taq DNA聚合酶最适工作温度为聚合酶最适工作温度为75-80。该酶具有。该酶具有53聚合酶活性，在镁离子存在情况聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿下可催化核苷酸沿53方向发生聚合反应。方向发生聚合反应。3、DNA聚合酶聚合酶4、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸四种脱氧核苷三磷酸即四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和和dGTP，为，为PCR反应中反应中DNA合成原料。合成原料。在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核
8、酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。缓冲液提供缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、Tris-Cl和和MgCl2。其中其中Mg2的浓度最重要，它能影响的浓度最重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与聚合酶的活性，以及模板与PCR产物的产物的解链温度。解链温度。5、缓冲液、缓冲液1.变性：是指模板的热变性，双螺旋模版变性：是指模板的热变
9、性，双螺旋模版DNA成为单链的成为单链的DNA分子；在应用分子；在应用Taq DNA聚聚合酶进行合酶进行PCR反应时，变性往往在反应时，变性往往在9495条件下进行。这也是条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进聚合酶进行行30个左右的个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。2.退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低的熔解温度低510，PCR实验要对退火温度进行优化。实验要对退火温度进行优化。三、三、
10、PCR基本步骤基本步骤3.延伸：在镁离子存在条件下，延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的在引物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成与模版方向生成与模版DNA互补的新互补的新DNA链。链。双链模版双链模版DNA变性变性退火退火5353553355335533上游引物上游引物下游引物下游引物延伸延伸35533553多次循环多次循环（2n 拷贝）拷贝）下面为一个典型的下面为一个典型的PCR循环参数设置：循环参数设置：备注：备注：*比两条引物的比两条引物的Tm值低值低510。94 5 min 94 30 s
11、 X*30 s 72 1 kb/min 72 5 min25-35个循环个循环四、影响四、影响PCR因素因素 虽然虽然PCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCR的特异性和高效性。的特异性和高效性。1.引物引物2.变性温度和时间变性温度和时间3.退火温度和时间退火温度和时间4.延伸温度和时间延伸温度和时间5.循环次数循环次数引物决定了引物决定了PCR产物的长度和特异性。产物的长度和特异性。引物的设计要求请看本实验讲义引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计引物设计”部分。部分。1、引物、引物在在PCR反应刚开始时，为保证作为模板的双链反应刚开始时，为保
12、证作为模板的双链DNA完全变性成单链完全变性成单链DNA，一般设为，一般设为95、5 min；在随后的循环中，可设为；在随后的循环中，可设为95、30s。有些模板有些模板DNA的的G+C含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间会影响会影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。2、变性温度和时间、变性温度和时间退火温度与引物的退火温度与引物的Tm值相关，一般比值相关，一般比Tm值低值低510。退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与
13、模板的结合而降低而降低PCR效率。效率。在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为设置为30s基本上就足够了。基本上就足够了。3、退火温度和时间、退火温度和时间Tm值的计算值的计算一般的公式：一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)所用所用DNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如Taq聚合酶的
14、最佳温度为聚合酶的最佳温度为7080度，所以延伸温度设为度，所以延伸温度设为72即可。即可。在实践中在实践中Taq DNA聚合酶的延伸效率约为聚合酶的延伸效率约为500 bp/30 s，若待扩增的片段较长，可，若待扩增的片段较长，可适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。4、延伸温度和时间、延伸温度和时间在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素，在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素，PCR产产物不再呈指数增加，此时称为平台效应。物不再呈指数增加，此时称为平台效应。循环次数设为循环次数设为2530
15、次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会导次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。5、循环次数、循环次数五、五、PCR引物设计引物设计 引物设计是引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提
16、交模板序列到特定网页，得到设计引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计的原则引物设计的原则v引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补v引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构v引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA DNA 聚合反应聚合反应(即错配即错配)v如引物长度（如引物长度（primer length），产物长度（），产物长度（product length），
17、序列），序列Tm 值值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability,用用G 值反映值反映)，形，形成引物二聚体成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在）的能值，在错配位点（错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的）的引发效率，引物及产物的GC 含量（含量（composition），），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。等等。必要时还需对引物
18、进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。具体因素具体因素一般原则一般原则v引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp，常用的是，常用的是18-24 bp，但不应大于，但不应大于38。v引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的。是必要的。v例如：一个长度为例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点个潜在的退火位点(3 x 109/412=200)。而一个长度为而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/40
19、0个。个。v较长的引物（较长的引物（28-35bp)v一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点 2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物易导致错配。引物3端出现端出现3 个以上的连续碱基，如个以上的连续碱基，如GGG 或或CCC，也会使错误引发，也会使错误引发机率增加。机率增加。3，引物，引物3端的末位碱基对端的末位碱基对Taq 酶的酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在合成效率有较大的
20、影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他的错配效率明显高于其他3 个碱基，因个碱基，因此应当避免在引物的此应当避免在引物的3端使用碱基端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。反应失败。5端序列对端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4.引物序列的引物序列的GC 含量一般为含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的的GC含
21、量不能相差太大。含量不能相差太大。不同的算法推荐不同的算法推荐45-55%或或50-60%5.G 值是指值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用稳定性。应当选用3端端G 值较低（绝对值不超过值较低（绝对值不超过9），而），而5端和中间端和中间G 值相对较高值相对较高的引物。引物的的引物。引物的3端的端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反聚合反应。（能值越高越容易结合）应。（能值越高越容易结合）6.对引物的修饰一般是在对引物的修饰一
22、般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物产物的载体的相应序列而确定。的载体的相应序列而确定。7.引物二级结构对引物二级结构对PCR反应的影响。反应的影响。尽可能少的引物二聚体。尽可能少的引物二聚体。常用的引物设计软件常用的引物设计软件vOligo 6（引物评价）（引物评价）*vPrimer Premier（自动搜索）（自动搜索）*vVector NTI SuitvDnasisvOmigavDnastarvPrimer3 （在线服务）（在线服务）*Primer Premier 5.0 的使用技巧简介的使用技巧简介主要功能主要功能:1、即
23、引物设计、即引物设计2、限制性内切酶位点分析、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元基元(motif)查找查找4、同源性分析、同源性分析使用介绍使用介绍(1)Preimer Premier 启动界面启动界面Load sequence基本信息基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好种密码子偏好Choose a function 引物设计界面引物设计界面First you c
24、an design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型引物类型搜索模式搜索模式5引物位置范围引物位置范围3引物位置范围引物位置范围产物大小范围产物大小范围引物长度引物长度搜索结果搜索结果28对引物对引物引物分值引物分值100分为满分分为满分每对引物的信息每对引物的信息双击选中一对引物双击选中一对引物引物信息引物信息回到主窗口回到主窗口引物及产物信息引物及产物信息是否出现是否出现hairpin,dimer,false pri
25、ming and cross dimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 引物编辑引物编辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main windowOligo 6.44 使用说明使用说明主要功能：专门的引物设计软件主要功能：专门的引物设计软件Oligo 6.44 启动界面启动界面Open sequence file3个弹出窗口个弹出窗口Melting t
26、emperatureMelting temperatureG Internal StabilityFrq为邻近为邻近6至至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。频率高则可增加错误引发的可能性。用用Oligo 设计引物时的设计引物时的3个标准个标准vTm 值曲线以选取值曲线以选取5到到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。的下降形状有利于引物引发聚合反应。vFrq 曲线宜选用曲线宜选用3端端Frq 值相对较低的片段。值相对较低的片段。vG 值在值在5端和中间值比较高，而在端和中间值比较高，而在
27、3端相对低端相对低选中引物选中引物上游引物上游引物下游引物下游引物只是示意图只是示意图引物分析引物分析v首先检查引物二聚体尤其是首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性；端二聚体形成的可能性；v第二项检查是发夹结构（第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好；）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好；v第三项检查为第三项检查为GC 含量，以含量，以45-55为宜；为宜；v第四项第四项False priming 检查。检查。引物分析引物分析Key information of primerHairpinDimer and cross DimerGC%Tot
28、al PCR informationFinal PCR informationSearch primerOnline primer3 service 凝胶准备凝胶准备 称称1g琼脂糖置三角瓶中，加琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1TAE；微波炉加热大约微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；分钟，熔化琼脂糖；熔化的琼脂糖自然冷却到熔化的琼脂糖自然冷却到6070时，加入时，加入EB 5l，并轻轻混匀。，并轻轻混匀。胶床准备胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；的间隙；将胶床放在调整好的水平台上；将胶床放在调整好的水平台上
29、；铺胶：将冷却致铺胶：将冷却致60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；室温下静置室温下静置30分钟左右，凝胶固化。将带凝胶分钟左右，凝胶固化。将带凝胶 的胶床置于电泳槽中，并使样品的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；孔位于电场负极；六、六、PCR产物电泳鉴定产物电泳鉴定向电泳槽中加入向电泳槽中加入1TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀的上样缓冲液
30、，用加样器轻轻混匀上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为10l盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；电泳条件：电压电泳条件：电压80v；时间；时间2025分钟；分钟；电泳结束后，切断电源，取出凝胶；电泳结束后，切断电源，取出凝胶；电泳结果分析：电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带紫外检测仪直接观察电泳条带 摄影记录摄影记录 琼脂糖凝胶电泳预期结果：琼脂糖凝胶电泳预期结果：500 bp560 bpPCR产物的直接测序：从琼脂糖凝胶中回收产物的直接测序：从琼脂糖凝胶中回收PCR产物后测序
31、。产物后测序。PCR产物连接到载体后测序：从琼脂糖凝胶中回收产物连接到载体后测序：从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，利用连接酶将产物，利用连接酶将PCR产物连接到载体如产物连接到载体如pGEM-T后，转化大肠杆菌提取质粒后测序。后，转化大肠杆菌提取质粒后测序。美国应用生物系统公司美国应用生物系统公司 3130 基因分析仪基因分析仪 24 小时无人监控操作小时无人监控操作 仪器设置更方便更简单仪器设置更方便更简单 新型自动灌胶系统进行灌胶新型自动灌胶系统进行灌胶 检测池加热器改进了温度控制检测池加热器改进了温度控制 通过通过 96 孔和孔和 384 孔板自动进样孔板自动进样 多色荧光检测多色荧光检测
32、 七、七、PCR产物测序鉴定产物测序鉴定观看测序结果的软件观看测序结果的软件Chromas软件运行界面软件运行界面打开一个测序结打开一个测序结果果峰型排列良好，无高大杂峰，说明测序结果可靠峰型排列良好，无高大杂峰，说明测序结果可靠将测序结果输出为文本文件将测序结果输出为文本文件虽然现在的虽然现在的PCR技术使技术使PCR扩增有很高的真实性，即扩增有很高的真实性，即PCR产物与模板产物与模板DNA的一致性很的一致性很高，但由于高，但由于PCR扩增毕竟是在试管内进行的扩增毕竟是在试管内进行的DNA复制，没有类似细胞内复制，没有类似细胞内DNA错配修复错配修复机制，所以，在机制，所以，在PCR产物扩
33、增以后，仍要分析其与模板产物扩增以后，仍要分析其与模板DNA的是否完全一致。最好的的是否完全一致。最好的方法是将方法是将PCR产物测序，将测序结果与数据库作序列比对分析。产物测序，将测序结果与数据库作序列比对分析。八、目的基因序列变异分析八、目的基因序列变异分析 核酸序列比对核酸序列比对 BLAST分析界面分析界面输入测序结果输入测序结果结果界面之一结果界面之一结果界面之二结果界面之二九、九、PCR污染的产生及防治污染的产生及防治PCR污染的监测污染的监测 vPCR强大扩增能力强大扩增能力+检测的敏感性检测的敏感性v经经30个周期后，特定个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加片段的数量在
34、理论上可增加109倍倍v极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题 NTC(No Template Control):必必须须设设置置一一个个不不含含模模板板DNA但但含含有有PCR系系统统中中所所有有其其他他成成分分的的对对照照反反应应，这这一一对对照管须在准备好所有其他照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。以后才进行吸加。常见的常见的PCR contamination v常规常规PCRv荧光定量荧光定量PCRNTC432176598NTC引起引起PCR污染的原因污染的原因模板间交叉污染模板间交叉污染v容器被污染容器被污染v
35、模板放置时模板放置时,由于密封不严溢于容器外由于密封不严溢于容器外v容器外粘有模板而造成相互间交叉污染容器外粘有模板而造成相互间交叉污染v模板吸取过程中模板吸取过程中,因气溶胶（因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染叉污染引起引起PCR污染的原因污染的原因PCR试剂污染试剂污染vPCR 试剂配制过程中试剂配制过程中,移液器、容器、水等原因造成试剂被移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR 核酸模板污染。核酸模板污染。引起引起PCR污染的原因污染的原因PCR产物污染产物污染-最主要最常见最主要最常见vPCR 产物拷贝量大，极微量的
36、产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染产物污染,就可形成假阳性。就可形成假阳性。v移液器吸取移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCR mixvPCR产物的气溶胶污染：产物的气溶胶污染：一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝气溶胶（气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中）：悬浮于气体介质中粒径一般为粒径一般为 0.001m1000m的固体、的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操在操作时比较剧烈地摇动反应管作时比较
37、剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶引起引起PCR污染的原因污染的原因实验室中克隆质粒的污染实验室中克隆质粒的污染v克隆质粒浓度高克隆质粒浓度高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,其污染可能性也很大其污染可能性也很大防止防止PCR污染污染首要原则首要原则v永远要设置永远要设置NTC对照对照 如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信v准备准备PCR的移液器要专用的移液器要专用
38、千万不能千万不能用吸取用吸取PCR产物产物/克隆质粒的移液器去准备克隆质粒的移液器去准备PCR 体系体系防止防止PCR污染污染空间：空间：合理分隔实验区域合理分隔实验区域:将样品的处理、配制将样品的处理、配制PCR反应液、反应液、PCR循环扩增及循环扩增及PCR产物的鉴定产物的鉴定等步骤分区进行，特别注意样本处理及等步骤分区进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。产物的鉴定应与其它步骤严格分开。理想状态：理想状态：各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或或RNA。防
39、止防止PCR污染污染操作操作v一旦进入吸加一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。v准备专供自己使用的准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。v选择质量好的选择质量好的Eppendorf管管-密封性好且开管不需要太大力气。密封性好且开管不需要太大力气。v打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。体溅出。v实验结束后
40、及时清理台面。实验结束后及时清理台面。防止防止PCR污染污染移液器操作移液器操作由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。分小心。1）准备）准备PCR的移液器专用的移液器专用2）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。染或产生气溶胶污染。3）最好在加完所有其他反应成分后才吸）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。加模板。4）推荐在准备）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪
41、头过程中使用滤芯枪头出现污染后解决办法出现污染后解决办法v更换试剂更换试剂 更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用v清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等 1）实验台面、超净工作台用现配的）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或双氧水或10%次氯酸钠溶液擦拭清洁。次氯酸钠溶液擦拭清洁。2）或者用）或者用10%漂白粉溶液擦拭漂白粉溶液擦拭 3)紫外光照射，照射距离应不超过紫外光照射，照射距离应不超过90 cm，照射时间最好过夜。，照射时间最好过夜。v实验过程中更加小心
42、，采用前面提到的各种防止污染的办法实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法十、十、Colony PCRCloningvCloning is the way in which we can take a single molecule,and make lots of bacterial cells that contain an identical molecule.vThese cells are clones,hence the namevThis used to be the only way to amplify DNA.It is still by far the mos
43、t accurate.Imperfect sciencevMost of the plasmid/insert combinations will not ligatevMost of the bacteria will not be transformedvWe only need one molecule to get into one bacterium to make one colonyPCR from clonesvOften clones will religate containing any old DNA(eg primer dimers).vThe DNA can go
44、in in either orientationvWe can use the PCR to tell which colonies have the insert we want,and which orientation it is in.Site-mutation PCRPrimer Design GuidelinesvBoth mutagenic primers must contain the desired mutation and anneal to the same sequence on opposite strands of the plasmid.vPrimers sho
45、uld be between 25 and 45 bases in length,with a meltingvtemperature(Tm)of 78C.vThe desired mutation(deletion or insertion)should be in the middle of the primer with 1015 bases of correct sequence on both sides.vThe primers optimally should have a minimum GC content of 40%and should terminate in one
46、or more C or G bases.vPrimers need not be 5 phosphorylated but must be purified either by fast polynucleotide liquid chromatography(FPLC)or by polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE).vFailure to purify the primers results in a significant decrease in mutation efficiency.v It is important to keep primer concentration in excess.Stratagene suggests varying the amount of template while keeping theconcentration of the primer constantly in excess.Overlap PCRvGene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extensionvKarin L Heckman&Larry R PeasevNature Vol2:924-928