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1、第五节第五节 PCR技术的扩展和应用技术的扩展和应用 多重多重PCR(Multiplex PCR)Inverse PCR Nested PCR Anchored PCR 不对称不对称PCR技术技术 Tail-PCR 多重多重PCR(multiplexPCR(multiplex PCR)PCR)1.1.原理原理在一个在一个PCRPCR反应体系中加入多对特异性引物反应体系中加入多对特异性引物,针针对多个对多个DNADNA模板或同一模板的不同区域扩增多模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的个目的片段的PCRPCR技术。这一概念由技术。这一概念由ChamberianChamberian等于等于19
2、881988年提出。年提出。优点：多重优点：多重PCRPCR同时扩增多个目的基因同时扩增多个目的基因,可节省可节省时间、降低成本、提高效率时间、降低成本、提高效率,特别是节省珍贵特别是节省珍贵的实验样品。的实验样品。2.应用应用2.1 医学研究与应用医学研究与应用如病原微生物的检测与鉴别，可同时进行多种病如病原微生物的检测与鉴别，可同时进行多种病原微生物的鉴定。原微生物的鉴定。2.2 植物学研究植物学研究在植物分子育种、基因表达研究、种质纯度鉴定、在植物分子育种、基因表达研究、种质纯度鉴定、病虫害检测等方面病虫害检测等方面,多重多重PCR 也得到重视。也得到重视。2.3 海洋生物学研究海洋生物
3、学研究海洋浮游生物数量庞大，种类繁多，而且幼体海洋浮游生物数量庞大，种类繁多，而且幼体时期外形相似。研究发现，不同种类浮游生物时期外形相似。研究发现，不同种类浮游生物细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶I 的的DNA差异明显，据此，研差异明显，据此，研究者可通过设计特异性引物，采用多重究者可通过设计特异性引物，采用多重PCR 方法进行分类鉴定。方法进行分类鉴定。3.多重多重PCR的技术要素的技术要素一个理想的多重一个理想的多重PCR 反应体系，并非单一反应体系，并非单一PCR 的简单混合，需要针对目标产物，进行的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、反复试验，建立适宜的反应体系全面分析、反复试验，
4、建立适宜的反应体系和反应条件。多重和反应条件。多重PCR 的技术要素主要包括的技术要素主要包括目的片段选择、引物设计、复性温度和时间、目的片段选择、引物设计、复性温度和时间、延伸温度和时间、各反应成分的用量等。多延伸温度和时间、各反应成分的用量等。多重重PCR 的目标是多个目的片段的扩增，因此的目标是多个目的片段的扩增，因此目的片段的选择是核心。目的片段的选择是核心。目的片段必须具有高度特异性，目的片段必须具有高度特异性，各个目的片段之间需具有明显的长度差异，以各个目的片段之间需具有明显的长度差异，以利于鉴别。利于鉴别。各个引物必须高度特异，避免非特异性扩增各个引物必须高度特异，避免非特异性扩
5、增;不同引物对之间互补的碱基不能太多，否则引不同引物对之间互补的碱基不能太多，否则引物之间相互缠绕，严重影响反应结果。物之间相互缠绕，严重影响反应结果。复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有目的片段的长度。及其浓度，还有目的片段的长度。多重多重PCR 反应中，在反应中，在Tm 值允许范围内，选择值允许范围内，选择较高的复性温度以确保较高的复性温度以确保PCR 反应的特异性。反应的特异性。复性时间略微延长，以使引物与模板之间完全复性时间略微延长，以使引物与模板之间完全结合。结合。延伸反应的时间不宜过长，否则会导致非特异延伸反应的时间不宜过长
6、，否则会导致非特异性扩增带的出现。性扩增带的出现。反应体系中适当增大模板反应体系中适当增大模板DNA、引物、聚合酶、引物、聚合酶、dNTP的用量，调整缓冲液组分，以获得最佳的用量，调整缓冲液组分，以获得最佳扩增效果。扩增效果。反向反向PCR（Inverse PCR,IPCR）扩增位于靶扩增位于靶DNA区段之外的两侧未知的区段之外的两侧未知的DNA序列序列此方法在分子生物学研究中应用广泛，可以用于此方法在分子生物学研究中应用广泛，可以用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，克检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，克隆基因的邻接序列以及建立基因组步移文库等。隆基因的邻接序列以及建立基因组步移
7、文库等。IPCR技术一般只能获得技术一般只能获得2.0 kb以内的片段。以内的片段。DNA的酶解程度、自连接效率以及引物在基因组的酶解程度、自连接效率以及引物在基因组中的相对专一性是中的相对专一性是IPCR 成功的关键成功的关键:(1)如果如果DNA酶切不完全，可能因片段过长而导致无法扩酶切不完全，可能因片段过长而导致无法扩增或扩增得到多个产物带。实验中使用过量限制增或扩增得到多个产物带。实验中使用过量限制性内切酶、大酶切体积和长时间处理非常必要。性内切酶、大酶切体积和长时间处理非常必要。(2)在酶解片段的自连接反应中，如果在酶解片段的自连接反应中，如果DNA浓度过高或反应体积过小，则可能导致
8、生成浓度过高或反应体积过小，则可能导致生成串联多聚体。串联多聚体。(3)普通普通IPCR反应使用的引物反应使用的引物一般长一般长20 nt，退火温度相对较低，在以总基，退火温度相对较低，在以总基因组因组DNA的酶解自连物为模板进行扩增时，的酶解自连物为模板进行扩增时，很可能发生非特异匹配，导致非目标产物的很可能发生非特异匹配，导致非目标产物的生成。可以使用较长的两个特异引物生成。可以使用较长的两个特异引物(25 nt30 nt)，退火温度高，可最大程度地减少，退火温度高，可最大程度地减少由引物非特异匹配引起的假阳性片段扩增。由引物非特异匹配引起的假阳性片段扩增。巢式巢式PCR（Nested P
9、CR）利用两对以上的引物扩增出不同长度片断的技术。利用两对以上的引物扩增出不同长度片断的技术。第一对引物：外部长片断扩增引物；第一对引物：外部长片断扩增引物；第二对引物：内部短片断扩增引物。第二对引物：内部短片断扩增引物。巢式巢式PCR是为了从一个是为了从一个DNA模板的同一区域扩增模板的同一区域扩增出不同长度片断即外部长片段和内部短片段而设出不同长度片断即外部长片段和内部短片段而设计的特殊方法，前者的引物称外长引物，后者的计的特殊方法，前者的引物称外长引物，后者的引物称内部引物，特异地称为巢式引物，由它扩引物称内部引物，特异地称为巢式引物，由它扩增出的片段也称套组片段。两类产物（外长和套增出
10、的片段也称套组片段。两类产物（外长和套组片段）的组片段）的 Tm值是不同的，因此在外引物和套组值是不同的，因此在外引物和套组引物与各自靶位点融合的温度不同。引物与各自靶位点融合的温度不同。在设计引物时，必须使外引物的在设计引物时，必须使外引物的GC%含量高于含量高于内引物，因而在一个含有不同引物的反应管中，内引物，因而在一个含有不同引物的反应管中，早期的早期的PCR循环中，长引物在较高的温度下与循环中，长引物在较高的温度下与模板特异结合，此时内因物是被排斥的，因此模板特异结合，此时内因物是被排斥的，因此扩增产物是外长片段，在后期扩增产物是外长片段，在后期PCR循环时，由循环时，由于融合温度改变
11、到只适于套组引物，外引物是于融合温度改变到只适于套组引物，外引物是被排斥的，因此，此时的扩增产物是套组片段。被排斥的，因此，此时的扩增产物是套组片段。因此，巢式因此，巢式PCR的关键是引物设计，可以在外的关键是引物设计，可以在外引物引物5端增加多个端增加多个GC钳子（钳子（GC-clamp）达到）达到扩增片断的目的。扩增片断的目的。第一次循环时，外引物的融合温度只能比没第一次循环时，外引物的融合温度只能比没有有GC-clamp的引物稍高一点，在起始循环后，的引物稍高一点，在起始循环后，由于由于GC-clamp已导入初级产物，因此以后已导入初级产物，因此以后的融合温度可以提高。的融合温度可以提高
12、。由于采用了两种不同退火温度的引物，所以由于采用了两种不同退火温度的引物，所以巢式巢式PCR的程序与普通的程序与普通PCR不同，整个程序不同，整个程序中某个阶段一些引物工作，另一些引物中某个阶段一些引物工作，另一些引物“休休闲闲”，在另一阶段，在另一阶段，“休闲休闲”的引物开始工的引物开始工作。作。巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列（如可以增加有限量靶序列（如稀有稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了）的灵敏度，并且提高了困难困难PCR的特异性。的特异性。另外，如果大片断扩增错误，则小片另外，如果大片断扩增错误，则小片断错误扩增的概率很大断错误扩增的概率很大。锚定锚定PCR（Anchored PC
13、R）以基因组总以基因组总DNA 为起始材料为起始材料,用于克隆某一已知用于克隆某一已知片段的侧翼序列片段的侧翼序列,如分离某一基因的调控序列如分离某一基因的调控序列,分分析析T-DNA 或转座子插入突变体等。或转座子插入突变体等。锚定锚定PCR 方法方法主要由以下主要由以下3 个步骤组成个步骤组成:()以基因组总以基因组总DNA 为模板为模板,用一条基因特异性引物用一条基因特异性引物(GSP1)进行线性进行线性PCR扩增扩增,产生单链扩增产物产生单链扩增产物;()在末端转移酶在末端转移酶的作用下的作用下,在单链在单链DNA 分子的分子的3末端加上多聚胞末端加上多聚胞嘧啶嘧啶;()用巢式基因特异
14、性引物用巢式基因特异性引物(GSP2)和与多和与多聚胞嘧啶配对的锚定引物聚胞嘧啶配对的锚定引物(AAP)对加尾的产物进行对加尾的产物进行PCR扩增扩增,PCR 产物连入载体后进行测序鉴定。产物连入载体后进行测序鉴定。DNADNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3 3 CCCCCCCC5 5 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3 3CCCCCCCC5 5 GGGGGGGG首先合成第一链首先合成第一链DNA，然后再添加一同聚物尾，然后再添加一同聚物尾（polydC)，与同聚物尾配对的，与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限锚定引物（带有限制性内切位点制性内切位点polydG)一起作一起作PCR扩增扩增5
15、 5 不对称不对称PCR用来序列的单链用来序列的单链DNA 热不对称交错热不对称交错PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR,简称简称TAILPCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA 序列序列的分子生物学技术。该技术由的分子生物学技术。该技术由Liu 和和Whitter 首先首先研究并报道。在分子生物学研究领域中，利用该技研究并报道。在分子生物学研究领域中，利用该技术分离出的术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针，也可以直接测序。谱绘制的探针，也可以直接测序。TAILPC
16、R 技术原理：技术原理：由一个特异性引物和一个简并引物组合构成由一个特异性引物和一个简并引物组合构成的的PCR 反应叫做反应叫做“半特异性半特异性PCR。这种反。这种反应会产生应会产生3 种不同类型的产物种不同类型的产物:(1)由特异性由特异性引物和简并引物扩增出的产物引物和简并引物扩增出的产物;(2)由同一由同一特异性引物扩增出的产物特异性引物扩增出的产物;(3)由同一简并由同一简并引物扩增出的产物。引物扩增出的产物。在在TAILPCR 反应中反应中,后两种非目标产物可后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。来消除。TAIL-PC
17、R 技术的基本原理是利用目标序列技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计旁的已知序列设计3 个嵌套的特异性引物个嵌套的特异性引物(special prime,简称简称sp1，sp2，sp3，约，约20 bp),用它们分别和用它们分别和1个具有低个具有低Tm 值的短的值的短的(14 bp)随机简并引物随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称简称AD)相组合相组合,以基因以基因组组DNA 作为模板作为模板,根据引物的长短和特异性根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应通过分级反应来扩增特异引物来扩增特异引物TAIL
18、PCR 一般分为一般分为3 次反应次反应，第，第1 次次PCR 反反应由应由5 次高特异性反应、次高特异性反应、1 次低特异性反应、次低特异性反应、10 次较低特异性反应和次较低特异性反应和12 次热不对称的超级循环次热不对称的超级循环构成。通过构成。通过5 次高特异性的反应，使次高特异性的反应，使sp1 与已知与已知的序列的序列(载体或载体或T-DNA等等)退火并延伸退火并延伸,提高目标提高目标序列的浓度。序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上，合到较多的目标序列上，10 次较低特异性的反次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火应使两种
19、引物均能与模板退火,随后进行随后进行12 次次TAIL 循环循环(即高特异性和低特异性循环交替即高特异性和低特异性循环交替)。经过上述反应得到了不同浓度的经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物：种类型的产物：特异性产物特异性产物(型型)和非特异性产物和非特异性产物(型和型和型型)。第第2次反应则将第一级反应的产物稀释一定次反应则将第一级反应的产物稀释一定 倍数后作为模板，通过倍数后作为模板，通过10 次热不对称的超次热不对称的超级循环，使特异性的产物被选择性地扩增，级循环，使特异性的产物被选择性地扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量。而非特异性的产物被压制到极低的含量。第第3 次反应
20、又将第次反应又将第2 次反应的产物稀释一定次反应的产物稀释一定倍数后作为模板，一般设置为普通的倍数后作为模板，一般设置为普通的PCR 反应或热不对称的超级循环。通过上述反应或热不对称的超级循环。通过上述3 次次PCR 反应可获得与已知序列邻近的目标序反应可获得与已知序列邻近的目标序列。列。反应反应 循环数循环数 温度温度 时间时间(s)(s)温度温度 时间时间(s)(s)温度温度 时间时间(s)(s)第一轮第一轮 1 93 60 95 60 5 94 30 63 60 72 150 1 94 30 *72 150 10 94 30 44 60 72 150 12 94 30 63 60 72
21、150 94 30 63 60 72 150 94 30 44 60 72 150 1 72 300第二轮第二轮 10 94 30 63 60 72 150 94 30 63 60 72 150 94 30 63 60 72 150 94 30 44 60 72 150 1 72 300*:25 保持保持180 s 后以后以0.3/s 升温至升温至72反应反应 循环数循环数 温度温度 时间时间(s)(s)温度温度 时间时间(s)(s)温度温度 时间时间(s)(s)第三轮第三轮 20 94 30 63 60 72 150 94 30 63 60 72 150 94 30 44 60 72 150
22、 1 72 600TAIL-PCR的引物设计的引物设计根据载体的已知序列设计根据载体的已知序列设计3 个与其边界距离不等的个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物，特异性引物的长度约嵌套的特异性引物，特异性引物的长度约20 bp，Tm 一般为一般为5868。按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物，简并引物相对较短，长度为计一系列简并引物，简并引物相对较短，长度为14 bp,Tm 为为3048。在在TAIL-PCR 反应中，高特异性循环的退反应中，高特异性循环的退火温度设为火温度设为65 左右，较低特异性循环的左右，较低特异性循环的退火温
23、度设为退火温度设为44，低特异性循环的退火，低特异性循环的退火温度设为温度设为2530。反应体系中，特异性。反应体系中，特异性引物的浓度与普通的引物的浓度与普通的PCR 相同，简并引物相同，简并引物的浓度要高的浓度要高,一般为一般为2.55.0 mol/L，以，以满足引物的结合效率。满足引物的结合效率。TAIL-PCR产物分析产物分析多数情况下，第多数情况下，第1 次反应有较多的非特异性产物由次反应有较多的非特异性产物由sp1 和和AD 为引物扩增出的特异性片段在第为引物扩增出的特异性片段在第1 次反次反应中由于量少而不一定能显现出来。当用应中由于量少而不一定能显现出来。当用sp2 替代替代s
24、p1 进行第进行第2 次反应后，一些非特异性条带消失，次反应后，一些非特异性条带消失，特异性的产物被选择性地扩增而显现。欲增加产物特异性的产物被选择性地扩增而显现。欲增加产物的特异性，可以再把第的特异性，可以再把第3 次反应设置为次反应设置为TAIL 循环。循环。由于特异性引物在第由于特异性引物在第1 次反应中一般不能扩增到可次反应中一般不能扩增到可被检测的水平，因此可以省去第被检测的水平，因此可以省去第1 次反应产物的琼次反应产物的琼脂糖凝胶电泳分析，仅仅检测第脂糖凝胶电泳分析，仅仅检测第2 次和第次和第3 次反应次反应的产物来获得特异性的目标片段。的产物来获得特异性的目标片段。取第取第2 次反应产物和第次反应产物和第3 次反应产物成对点次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的，因此特异性扩样。由于特异引物是嵌套的，因此特异性扩增的特点是第增的特点是第3 次反应产物小于第次反应产物小于第2 次反应次反应产物。不同的产物。不同的AD 引物的扩增效率不同。有引物的扩增效率不同。有效的效的TAIL-PCR 扩增出的目标片段的大小应扩增出的目标片段的大小应该在该在250 bp2 kb。由于。由于AD 引物在特异性引物在特异性引物的下游有多个退火位点，同一目标序列引物的下游有多个退火位点，同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。