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1、PCR技术及其延伸与应用刘红亮 聚合酶链反应或多聚酶链反(Polymerase Chain Reaction,PCR）又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107108倍，大大提高了DNA的得率。PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。使用1976年Chien等分离的热稳定性Taq D
2、NA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。PCR已获得广泛应用,目前，每年都有上千篇文章发表。1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCR Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与Mullis同享此荣)瑞典皇家科学院说：“PCR方法已经广泛应用于生物医学中,该方法同
3、DNA测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。”现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。PCR技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。PCR的基本原理和基本程序 变性:先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，退火:加入上下游引物，与互补链杂交复性。延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5到3方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。循环扩增每次循环使延伸的模板增加1倍，亦即扩增
4、DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。预变性十分钟延伸保存PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。平台效应 靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应 PCR的特点 特异性高-聚合酶首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入；同时引物是在37延伸Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的，扩增过
5、程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上。应用证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。快速 简便 可扩增RNA或cDNA 试剂 引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物。耐热的DNA聚合酶：10PCR缓冲液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。dNTP贮备液 D
6、NA模板 操作程序 试剂混合PCR仪程序设计：94变性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72温育5min，以确保充分延伸。PCR反应基本条件及其对PCR的影响 模板核酸有机溶剂酚蛋白质污染核酸污染核酸的量 引 物 引物与PCR的特异性，引物限定扩增产物的大小。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。冻干引物于-20至少保存12-24个月，液体状态于-20可保存6个月。引物不用时应存于-20保存。缓冲液 缓冲液的目的：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mm
7、ol/LTris-HCl(Tris是一种双极性离子缓冲液，pH变化于之间。将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。50mmol/L以内的KCl，50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+。反应中加入小牛血清白蛋白（100g/ml）或明胶（0.01%）或Tween 20（0.05%0.1%）5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT）有助于酶的稳定，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时。Mg2+Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性。影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著
8、降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。DNA模板，引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。三磷酸脱氧核苷酸dNTP dNTP是DNA合成的基本原料。含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。dNTP浓度过高会导致其错误掺入（即所谓的“热力背信”）。一般认为最适的dNTP浓度为50200mol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段使 PCR得到广泛应用。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（Taq）中分
9、离出的热稳定性DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶简化了PCR程序,增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79），100l反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳，Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。温度循环参数 变性温度与时间 复性温度与时间 延伸温度与时间 循环数：PCR实验中常见问题对策 假阴性问题假阳性问题。假阴性 Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制引物设计不合理提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当循环次数不够假阳性 微量的靶基因污染标本间的交叉污染样品中存在有靶基因的同源序列PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、
10、简化操作程序，使用一次性吸头。PCR技术的延伸 PCR是一种技术和方法，在使用中不同的人根据自己的试验目的、结合自己的知识背景、研究、创造了不同的PCR方法，开拓了PCR应用的新领域。现在至少有15种不同的PCR用于不同的试验。反转录PCR-Reverse transcription PCR一种检测底丰度特异 的方法互补靶cDNA生成双链靶DNA扩增靶DNARTPCR反应体系PCR的反应体系但是模板是RNARNA酶抑制剂RNasin反转录酶 禽酶禽类成髓细胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus,AMV)鼠酶莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leuk
11、emia virus)Touch down PCR一般PCR的体系一般PCR的设计原理不同的PCR过程目的：在不知道理想退火温度的条件下保证扩出产物梯度PCR在特殊PCR仪上进行的一般PCR目的：寻找最佳的退火温度与TouchDown PCR的区别 TD PCR：对同一PCR体系采用不同的退火 温度进行 PCR循环 梯度PCR：同时对多个PCR体系采用不同的退火温度进行PCR循环巢（套）式PCR-nested Primer PCR不同的PCR体系两对引物不同的PCR过程两段循环目的：增加特异性和灵敏性复合PCRMultiplex PCR采用多对引物扩增多条目的片断目的：同时检测多种病原微生物关键问题 不同引物Tm应相差不大 目的片断大小相差不大反向PCRReverse PCR一般PCR的引物是相向的，而这里的引物是反向的。目的：扩增已知序列两端的序列方法：酶切连接成环