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1、已知基因序列的获取策略已知基因序列的获取策略获取序列信息，设计合适的引物选取相应的组织或细胞相应的组织或细胞，提取RNA并RTPCR扩增获得全长cDNA装入合适的克隆或表达载体，菌落菌落PCR、酶切与测序证实根据需要进一步进行亚克隆RNase H消化（可选）尽量减少RNAase污染nRNase的危害主要集中在将RNA pellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。n注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备。n长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶解总RNA沉淀如何确认RNA的质量nRNA的电泳图谱的电泳图谱n检测RN
2、A溶液的吸光度n保温试验n荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生物分析仪分析28S18S5SRT引物的选用nGSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RTPCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。nOligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；n随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。RT中提高合成全长cDNA的效率n消除mRNA 二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA 模板进行短暂的热变性,可破坏mRNA 二级结构,促进锚定引物与模板的正确配对。n选用RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶：
3、Thermoscript、Superscript 等，RT后建议进行RNase H消化处理。n锚定RT引物的选用：5(T)25V N3n热启动RTn有条件者选用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH(pH 8.5)1.0 mM EDTA 小于小于5微克微克可自己找公司合成可自己找公司合成建议用热盖建议用热盖PCR仪仪或空气浴孵箱保温或空气浴孵箱保温建议选用建议选用RNase H消化消化高保真DNA 多聚酶的选用n常用高保真DNA 多聚酶：如Pfu、Deep Vent、Vent、Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等nPCR过程中
4、HotStart与Touchdown的使用n高保真DNA 多聚酶与普通rTaq的混合使用nPCR产物加A尾进行T-A克隆：循环即将结束时加入rTaq 5U 72 保温2030 minn两步变温法PCR载体构建中的常见问题n利用单酶切位点将片段插入载体n双酶切中的问题n对过长cDNA片段:可分段扩增，再利用RE位点或重叠延伸融合成全长cDNAn酶切位点甲基化的问题 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC真核表达载体的选择nPromoter Conventional/Tissue-Specific/InduciblenPoly(A)tailnKozak序列：9GCCGCC
5、A/GCCAUGG4一个载体内的多基因表达nIRES系统n加linker直接融合表达n多个独立的表达 cassettes：优于共转染表达SOE技术与基因人工合成及多基因融合技术与基因人工合成及多基因融合n基因设计与人工合成中的密码子优化nDNAWorks 2.4(Hoover,D.and Lubkowski,J.,2002)http:/mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/SOE：Spliced by overlapping extension搭桥技术融合基因搭桥技术融合基因三、引物设计引物设计的引物设计的3条基本原则：条基本原则：n引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧
6、密互补n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，或发夹结构，n引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应聚合反应(即错配即错配)。引物设计注意事项n引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp。n引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。n引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。n5端序列的修饰与标记端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常
7、应在5端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。n简并引物简并引物：应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3端应不存在简并性端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。n同源性或互补性同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。nGC含量：含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。nTm值：值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。nG值：值：指DNA双链形成所需的自由
8、能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。Primer Premier 5.0n引物设计n限制性内切酶位点分析nDNA基元(motif)查找n同源性分析 Genetool V 2.0Oligo6.69四、测序图比对、拼接与虚拟克隆(in silico cloning)n常用本地软件：Clone manager、Vecto
9、r NTI、DNAstar和ds-Gene等n在线工具：BLAST等常用序列拼接软件nDNAstar 的SeqMan模块nVectorNTI程序的Contig Express模块nSequencher开始开始所有程序所有程序DNAstar SeqMan新的拼接任务新的拼接任务添加序列添加序列打开保存序列的文件夹打开保存序列的文件夹选择序列选择序列导入导入整理一下末端整理一下末端用鼠标拖动手用鼠标拖动手动更改末端动更改末端用鼠标点击更改序用鼠标点击更改序列方向和形式列方向和形式选择载体选择载体自动查找自动查找拼接拼接看看结果看看结果点开测序图点开测序图6种阅读框种阅读框选择的序选择的序列的位置列
10、的位置NCBI查询所选择的序列查询所选择的序列保存结果保存结果打印成打印成PDF文文件也是一个不件也是一个不错的选择错的选择运行运行VNTI 程序程序Contig Express程序窗口，可以设定参数，程序窗口，可以设定参数，一般用默认值即可。一般用默认值即可。导入测序结果（文导入测序结果（文件扩展名件扩展名ab1改成改成abi）相关软件）相关软件 EditView for Macs；Chroma for Windows 也可以用鼠标右键也可以用鼠标右键导入后可以双击查看和编辑各个测序结果导入后可以双击查看和编辑各个测序结果选择序列，根据实际情况调整序列末端选择序列，根据实际情况调整序列末端选择序列拼接选择序列拼接双击查看结果双击查看结果输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。开始开始所有程序所有程序导入序列导入序列选择序列选择序列此界面调整参数此界面调整参数详细说明详细说明拼接拼接双击查看结果双击查看结果输出结果输出结果