实验肿瘤学基本概念教学教材.ppt

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1、实验肿瘤学基本概念肿瘤细胞的生物学特点肿瘤细胞的生物学特点自我满足的生长信号自我满足的生长信号 对生长抑制信号不敏感对生长抑制信号不敏感 逃避凋亡逃避凋亡 无限增殖的潜能无限增殖的潜能 血管生成血管生成 浸润和转移浸润和转移实验肿瘤模型的要求实验肿瘤模型的要求忠实地重现人类肿瘤的生物学特性忠实地重现人类肿瘤的生物学特性实验肿瘤学的研究方法实验肿瘤学的研究方法直接研究直接研究建立细胞系建立细胞系建立动物模型建立动物模型细胞系的基本概念细胞系的基本概念组组织织培培养养和和细细胞胞培培养养：模模拟拟体体内内环环境境在在体体外外培培养养机机体体组织和细胞，使之生存和生长。组织和细胞，使之生存和生长。原

2、原代代培培养养（primary culture）:从从体体内内取取出出组组织织和和细细胞胞的的第一次培养。第一次培养。传传代代（passage）：细细胞胞长长满满培培养养瓶瓶后后，细细胞胞分分成成2-3瓶瓶继继续培养。续培养。细细胞胞系系（cell line）:原原代代培培养养细细胞胞首首次次传传代代成成功功后后的的细细胞胞，称称 细细 胞胞 系系。Finite cell line,continuous cell line,established cell line细细胞胞株株(cell strain):通通过过选选择择或或克克隆隆，从从亲亲代代细细胞胞系系选选出的带有特定标志的细胞群。出的带

3、有特定标志的细胞群。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养物收集中心,美国菌种保存中心培养细胞的生长方式贴附生长型细胞：细胞附着于支持物表面生长。上皮细胞型：来源于外胚层和内胚层的细胞，细胞为扁平多角形，细胞之间紧密相靠成片。成纤维细胞型：来源于中胚层的细胞，细胞呈梭形，排列成漩状、放射状、栅栏状。悬浮生长型：造血系统的细胞培养细胞的生长特点贴附生长：支持物可为玻璃、塑料、胶原、其他细胞等。停泊或贴壁依赖性细胞（anchorage-dependent cell)接触抑制(c

4、ontact inhibition)：正常细胞相互接触后，细胞将向另一个方向移动，从而使细胞不会重叠生长。密度抑制(density inhibition)：正常细胞汇合成片后细胞分裂停止，在静止状态下细胞存活一段时间 汇合 confluent培养条件培养条件基基 本本 营营 养养 成成 分分 RPMI1640 DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)谷谷氨酰胺氨酰胺生生长长因因子子 小小牛牛血血清清 胎胎牛牛血血清清 灭灭活活补补体体 56 30min 环境环境 37 pH 7.2-7.4 渗透压渗透压 无污染无毒无污染无毒 细菌、细菌、支原体支原体 体外培养

5、的优点体外培养的优点优点：优点：1.活细胞，活细胞，2.对对象象均均匀匀，易易控控制制实实验验条条件件，易易于于观观察察和和纪纪录实验结果录实验结果 3.易易研研究究单单个个细细胞胞的的结结构构和和功功能能，易易于于进进行行分分子生物学水平研究，子生物学水平研究，4.实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。体外培养的缺点体外培养的缺点 1.在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，G1 G0 终末分化终末分化肿瘤细胞肿瘤细胞 M S介质细胞介质细胞 G22.转转化化（transformation）:在在体体外外培培养养过

6、过程程中中细细胞胞的的遗遗传传性性状状发发生生变变化化。分分为为一一般般转化和恶性转化。转化和恶性转化。一般转化一般转化：指细胞获得不死性。：指细胞获得不死性。恶恶性性转转化化：指指出出现现在在软软琼琼脂脂培培养养基基中中浸浸 润润生生长长；在在动动物物体体内内成成瘤瘤；血血清清依依赖赖性性降降低；生长密度依赖性降低。低；生长密度依赖性降低。3.体外实验结果不能外推到体内实验体外实验结果不能外推到体内实验细胞培养的应用细胞培养的应用研究细胞与环境的相互作用研究细胞与环境的相互作用细胞间的相互作用细胞间的相互作用细胞内胞质活动细胞内胞质活动细胞质与细胞核之间的流动细胞质与细胞核之间的流动建立细胞

7、系的基本要求建立细胞系的基本要求细胞在体外培养半年以上，生长稳定，细胞在体外培养半年以上，生长稳定，保持细胞特征并能传代。保持细胞特征并能传代。建系方法建系方法1.原原代代培培养养：无无菌菌操操作作，取取肿肿瘤瘤组组织织，切切成成小小片片，小小于于0.5毫毫米米，进进行行培培养养，或或用用胰胰酶酶、胶胶原原酶酶消消化化成成单单细细胞胞悬悬液液，血清灭活酶，培养血清灭活酶，培养2.传代传代：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按1：2-3传代传代3.去除杂细胞去除杂细胞4.冻存细胞冻存细胞 10%DMFO+90%胎牛血清，胎牛血清，4 30min,-20 2hrs,2hr

8、s,-70-70 过过夜夜,液液氮氮，长长期期保存。保存。登记，定期复苏细胞。登记，定期复苏细胞。复苏：复苏：37 37 水浴，加培养基洗一次，培养水浴，加培养基洗一次，培养 5.鉴定鉴定鉴 定细胞形态观察细胞形态观察 癌细胞多角型，重叠生长，癌细胞多角型，重叠生长，核浆比例失调，多核巨细胞核浆比例失调，多核巨细胞染色体分析染色体分析 数量和核型、核带，标记染色体数量和核型、核带，标记染色体细胞生长曲线和细胞周期细胞生长曲线和细胞周期集落形成率集落形成率动物接种动物接种 成瘤，成瘤，组织形态学与原发肿瘤相似组织形态学与原发肿瘤相似污染污染 无病毒、无病毒、支原体污染支原体污染、细胞间交叉污染细

9、胞间交叉污染 Hela cell:1951年年 Henrietta Lack 宫颈癌宫颈癌 实验动物基础知识实验动物基础知识法法 规规1988年年 中华人民共和国实验动物管理条例中华人民共和国实验动物管理条例1989年年 医学实验动物管理实施细则医学实验动物管理实施细则1994年年 关关于于在在全全国国医医疗疗卫卫生生系系统统实实行行实实验验动动物物合合格格证证制制度度得得通通知知 （医医学学实实验验动动物物合合格格证证书书，医医学学实实验验动动物物环环境境设设施施合合格格证证书书，医医学学实实验验动动物物全全价价营营养养饲饲料料合合格证书，医学实验动物饲料生产条件合格证书格证书，医学实验动物

10、饲料生产条件合格证书）1988年年 广东省实验动物管理办法广东省实验动物管理办法基本概念基本概念 实实验验动动物物（laboratory animal）:指指人人工工培培育育的的、对对其其携携带带微微生生物物实实行行控控制制、来来源源清清楚楚、遗遗传传背背景清晰、可用于科学实验得动物。景清晰、可用于科学实验得动物。实实验验用用动动物物（animal for research）:能能用用于于科科学学实实验验的的动动物物，包包括括实实验验动动物物、野野生生动动物物、经经济动物和观赏动物。济动物和观赏动物。标标准准化化实实验验动动物物：有有明明确确的的遗遗传传背背景景、繁繁殖殖方方法法、饲饲养养环环

11、境境、饲饲料料成成分分均均达达到到标标准准的的实实验验动动物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。实验动物的分类实验动物的分类(遗传背景遗传背景)近近交交系系（纯纯系系）：连连续续20代代以以上上兄兄妹妹交交配配或或亲亲子子交交配配 而获得的遗传上达到一致的动物群。如而获得的遗传上达到一致的动物群。如BLAB/c小鼠。小鼠。杂杂交交群群:两两个个近近交交系系动动物物间间有有计计划划进进行行交交配配获获得得的的第第一代动物。一代动物。封封闭闭群群：由由同同一一血血缘缘品品系系进进行行自自由由交交配配，在在固固定定场场所所保存繁殖保存繁殖5年以上得动物群，如

12、年以上得动物群，如Wistar 大鼠、大鼠、SD大鼠。大鼠。突突变变系系：正正常常染染色色体体基基因因突突变变导导致致遗遗传传缺缺陷陷的的动动物物，如裸鼠如裸鼠按微生物控制分类按微生物控制分类一级一级：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。二二级级：清清洁洁动动物物，不不携携带带人人畜畜共共患患疾疾病病病病原原体体和和动动物物传传染染病病原体的动物。病病原体的动物。三三 级级：无无 特特 定定 病病 原原 体体 的的 动动 物物（specific pathogen free,SPF）,动动物物体体内内不不存存在在特特定定病病原原微微生生物物和和寄

13、寄生生虫虫的实验动物。的实验动物。四级四级：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。一一级级动动物物只只能能用用于于教教学学和和某某些些研研究究的的预预实实验验，卫卫生生部部以以上课题和研究生课题必须使用二级以上动物上课题和研究生课题必须使用二级以上动物免疫缺陷动物免疫缺陷动物裸小鼠（裸小鼠（nude mice）1962年英国发现。鼠年英国发现。鼠11号染色体裸基因号染色体裸基因nu是隐性突变基因。是隐性突变基因。裸基因纯合子（裸基因纯合子（nu/nu）鼠的特征）鼠的特征:1.全身无毛，裸体外表。全身无毛，裸体外表。2.胸腺上皮细胞不能增殖，胸腺上

14、皮细胞不能增殖，T细胞发育受阻，细胞发育受阻，T细胞免疫缺陷细胞免疫缺陷。3.B 细细胞胞形形态态正正常常，功功能能较较差差，免免疫疫球球蛋蛋白白以以 Ig M 为为主主，少少量量Ig G，类似于人原发细胞免疫缺陷。，类似于人原发细胞免疫缺陷。随着鼠龄增加，随着鼠龄增加，T细胞增加，移植实验一般用细胞增加，移植实验一般用4-8周鼠。周鼠。4.裸裸小小鼠鼠抵抵抗抗力力差差，易易患患病病毒毒性性肝肝炎炎和和肺肺炎炎，应应饲饲养养在在SPF 环境。环境。5.纯纯合合型型雌雌鼠鼠不不能能生生育育，/nu/+/nu/+和和/nu/nu/nu/nu交交配配可可获获 1/2 1/2 纯合子鼠。纯合子鼠。常用

15、常用BALB/c nu/nu,Swiss nu/nu,NC nu/nu。应 用建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型 研究致癌机理：1在裸鼠体内诱发人类肿瘤：EBV 2生物因素的致瘤性：多瘤病毒只在新生鼠或幼鼠诱发肿瘤，而在成年裸鼠也可在远离注射部位诱发肿瘤，在雌鼠为乳腺癌，雄鼠为骨肉瘤。裸大鼠(nude rat)1953年苏格兰在远交系hooded大鼠中发现，因饲养不当而绝种。1975年重新发现纯合子大鼠。纯合子 rnu/rnu 鼠无胸腺，缺乏功能性T细胞，抵抗力低下。严重联合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency mice,SCID)1982年美国发现于C.B-

16、17/ICR品系。Scid位于16号染色体，是隐性突变基因。纯合子scid/scid T细胞和B细胞功能缺陷，血清中无免疫球蛋白，外周血淋巴细胞数量明显减少。NK 细胞功能正常。接受单克隆抗体杂交瘤移植后易形成腹水瘤，可获得高纯度的单克隆抗体。SCID 鼠被毛发正常，雌雄可生育。动物肿瘤模型自发肿瘤：动物自然发生的肿瘤，发病过程与人类肿瘤相似，但发病时间早晚不一，不易在短期内得到实验结果。诱发肿瘤：用化学、物理、生物等因素在动物体内诱发的肿瘤。物理、生物因素诱发肿瘤的潜伏期长，发生率不稳定，常用化学因子诱发肿瘤。常用于肿瘤病因、化学预防的研究诱发肿瘤模型的基本要求简单易行、易重复选择对特定致癌

17、物敏感的动物种系：多环方香烃-皮肤/小鼠；甲基卞肼亚硝胺-食道癌/大鼠；甲基氨基偶氮苯-肝癌/大鼠恰当的致癌物剂量：动物存活率高，诱发周期短。诱发的肿瘤类似于人类肿瘤原位诱发：如：0.25二已基亚硝胺 0.251 ml 灌胃6月，70发生肝癌异位诱发：将与致癌物作用过的器官或组织移植于自体或同系、同基因正常动物皮下，诱发所需的肿瘤。如：甲基胆蒽穿线法穿入幼鼠子宫颈，将子宫颈切除，移植于同系成年小鼠皮下，3个月后诱发异位子宫颈癌可移植性肿瘤 肿瘤组织在同种或异种动物体内传代后获得的生物学特性学相对稳定的肿瘤。同种可移植性肿瘤 可分为实体瘤、腹水瘤、淋巴瘤、白血病 到1997年我国65株。腹水瘤：

18、将可移植性实体瘤接种于同种动物腹腔或腹壁，待肿瘤生长后形成腹水，再接接种于同系肿瘤。用于药物筛选。异种可移植性瘤：免疫力正常动物：免疫隔离区 如眼前房、脑内，或免疫抑制，如X线照射/可的松 免疫缺陷动物 移植部位原位移植（orthotopic implantation）异位移植(ectopic implantation)皮下、肾包膜下、腹腔可移植性肿瘤的参考标准传15-20代以上接种成活率100%，自发消消退率2年)的状态,此时肿瘤细胞处于G0期或增殖和凋亡相平衡。微小转移灶（micro-metastasis）:在原发灶以外用常规临床检查方法不能发现的肿瘤病灶微小残留灶：治疗后在原发灶遗留的小

19、量肿瘤细胞转基因动物肿瘤模型理论基础：1 肿瘤是癌基因突变/抑癌基因失活的结果 2 基因功能在进化中是保守的 转基因动物外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给后代的动物。用途：生物医药 基因表达调控 单基因表达调控 多基因表达调控 基因敲除（knock out)转基因方法 DNA 逆转录病毒/DNA转染 胚胎干细胞 显微注射受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 显微注射 逆转录病毒DNA DNA纤维注射与逆转录病毒转染的比较转基因方式 显微注射 逆转录病毒转染DNA导入 50kb,单细胞受精卵 10-15kb,46细胞卵培养液 M16 高营养液移卵 输卵管 子宫整合 随机整合，多拷贝 随

20、机整合，嵌合体，单拷贝表达 受旁侧序列影响 受病毒LTR影响，在一定范围内表达水平 易缺失 与拷贝数成正比传代 可传代 整合至生殖细胞的可传代显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序 供体母鼠 注射激素、交配 鼠受精卵目的基因 显微注射 注射DNA的受精卵 假孕母鼠 娩出幼鼠 鉴定C57BL/6肝癌模型p53-/-+p53+/+HBV+p53+/-HBV+p53+/+p53+/-HBV+P53+/-HBV-p53+/+HBV+P53+/+HBV-AFB1 10mg/kg i.pGroup HBV p53 AFB1 SEX N HCC Ia +/-+M 7 7/7 +/-+F 8 5/8 IIa +/+M 16 11/16 +/+F 6 0/6 IIIa -+/-+M 7 2/7 -+/-+F 9 1/9 IVa -+/+M 10 1/10 -+/+F 7 0/7 Ib +/-M 8 1/8 IIb +/+-F 5 0/5此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢