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1、实验实验1大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生生物原生生物特点：特点：结构简单结构简单,形体微小形体微小.通常要用光学显微镜或通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且且体内一般不含有叶绿素体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用不能进行光合作用.原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界一、基础知识：(一)微生物固体培养基：菌落，菌苔固体培养基：菌落，菌苔半固体培养基：半固体培养基：无动力无动力 有动力有动力(弥散弥散)(是否运动
2、是否运动)选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞 加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的核苷的培养基培养基:分离杂交瘤细胞分离杂交瘤细胞天然培养基有血清、天然培养基有血清
3、、血浆、和组织提取液血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：优点：营养成分丰富，营养成分丰富，培养效果好培养效果好缺点：缺点：来源受限来源受限;成分成分复杂，影响对某些实复杂，影响对某些实验产物的提取和实验验产物的提取和实验结果的分析结果的分析;易发生支易发生支原体污染原体污染;根据细胞生存所需物质的根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模种类和数量，用人工方法模拟合成的。拟合成的。合成培养基主要成分是合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物、无机盐和其它一些辅助物质。物质。优点：优点：标准化生产，组分标准化
4、生产，组分和含量相对固定和含量相对固定;成本低成本低 缺点：缺点：缺少某些成分，不缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需能完全满足体外细胞生长需要。要。合成培养基合成培养基:天然培养基：天然培养基：血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定
5、量的天然培养基（如血清）。繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。培养基的用途培养基的用途液体培养基：增菌，液体培养基：增菌，常用于发酵工业常用于发酵工业固体培养基：固体培养基：增菌，增菌，菌种保存及分离纯化、菌种保存及分离纯化、鉴定菌落、活菌计数等鉴定菌落、活菌计数等半固体培养基：动力检测，保种半固体培养基：动力检测，保种不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方调节调节pHpH2 2、成分、成分水、碳源、氮源、水、碳源、氮源、无机盐、无机盐、生长因子生长因子(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物化合
6、物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)真菌：真菌：5 56 6 细菌：细菌：6.5 6.5 7.5 7.5 有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压1.1.无菌操作的概念无菌操作的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止防止_污染的方法。污染的方法。四、无菌操作四、无菌操作_必须无菌、必须无菌、_也必须要无菌、也必须要无菌、_时不能带入其他杂菌时不能带入其他杂菌主要包括：主要包括：杂菌杂菌2.2.消毒与灭菌消毒与灭菌的概念及两者的区别的概念及两者的区别 消毒：消毒：使用使用较温
7、和理化因素较温和理化因素，仅杀死物体表面或内，仅杀死物体表面或内部的部的一部分一部分对人体有害的微生物的过程。对人体有害的微生物的过程。不能杀死不能杀死芽孢和孢子。芽孢和孢子。灭菌：灭菌：使用使用强烈的理化因素强烈的理化因素消灭物体内外消灭物体内外所有所有微生微生物，包括芽孢和孢子。物，包括芽孢和孢子。各种器具各种器具培养基培养基转移菌种转移菌种比较消毒与灭菌比比较较项项理化因理化因素的素的作用作用强强度度消消灭灭微微生物生物的数的数量量芽芽孢孢和和孢孢子子能否能否被消被消灭灭消消毒毒灭灭菌菌较为温和较为温和部分生活状态部分生活状态的微生物的微生物不能不能能能全部微生物全部微生物强烈强烈高压蒸
8、汽灭菌高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）（湿热灭菌）洒精灯灼烧灭菌洒精灯灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌（1 1）灭菌方法：）灭菌方法：3 3、常用的灭菌和消毒的方法、常用的灭菌和消毒的方法培养基、无菌水、培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具各种耐高温的玻璃金属器具100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min15-30min需要保持干燥需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿耐高温的玻璃金属器皿160-170 160-170 下加热下加热1-2h1-2h接种环等金属器具接种环等金属器具1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法
9、：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%75%酒精、新洁尔酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源4 4、紫外线消毒、紫外线消毒(2)消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶
10、和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：（答：（1 1）、（）、（2 2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3 3）需要消毒。）需要消毒。（一）制备（一）制备LBLB培养基（通用的细菌培养基）培养基（通用的细菌培养基）1 1、配方：蛋白胨、配方：蛋白胨0.50.5克，酵母提取物克，酵母提取物0.250.25克，克，氯化钠氯化钠0.50.5克，水克，水50ml50ml（配固体培养基再加琼脂（配固体培养基再加琼脂1 1克）克）溶解溶解计算称量计算称量调调pHpH分装分装加塞，包扎加塞，包扎2 2、流程、流程二二 操作步骤操作步骤灭菌灭菌倒平板倒平板分装：分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，
11、因此在注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用_。加塞加塞：试管用塑料盖或：试管用塑料盖或_；三角瓶口用；三角瓶口用_或或_封口封口,再用再用_或报纸封口。或报纸封口。包扎：包扎：用用_或报纸或报纸三角漏斗三角漏斗棉花塞棉花塞封口膜封口膜6 6层纱布层纱布牛皮纸牛皮纸牛皮纸牛皮纸高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法灭菌灭菌1 1）加水：）加水：2 2）装锅：）装锅：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是向外层锅内加入适量的水，加水的要求是_._.物品放置的要求物品放置的要求_：加盖：将盖上的加盖：将盖上的排气软管排气软管插入内层灭菌
12、桶的插入内层灭菌桶的_内。内。再以再以_方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。栓松紧一致，勿使漏气。不触及内胆不触及内胆整齐、稳定、留出空隙整齐、稳定、留出空隙排气槽排气槽两两对称两两对称3 3）加热排气：）加热排气：4 4）保温保压：）保温保压：5 5）出锅：）出锅：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的_。_后，关上排气阀。后，关上排气阀。当锅内压力升到当锅内压力升到_kg/cm_kg/cm2 2时，控制时，控制热源，维持压力至热源，维持压力至_min_min。切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压切断电源，让灭菌锅
13、内温度自然下降，当压力降至力降至_时，打开时，打开_，旋松螺栓，打开，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。盖子，取出灭菌物品。冷空气冷空气待冷空气完全排尽待冷空气完全排尽0 01 11515排气阀排气阀否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。发生污染，甚至使容器爆炸。灭菌后，通常将实验用具放入灭菌后，通常将实验用具放入6080 _6080 _中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_。烘箱烘箱污染污染倒平
14、板倒平板：待培养基冷却至：待培养基冷却至_ _ 时，将时，将每只培每只培养皿倒入养皿倒入_ml_ml未凝固的固体培养基，置未凝固的固体培养基，置于于_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。部，待凝，使之形成平面。_备用。备用。制斜面制斜面：将未凝固的固体培养：将未凝固的固体培养基的试管基的试管_放，冷却待凝使即放，冷却待凝使即成为斜面。成为斜面。10101212水平水平倒置倒置斜斜倒平板、制斜面倒平板、制斜面操作平台操作平台：灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开_和和_，灭菌，灭菌30min.30
15、min.过滤风过滤风紫外线紫外线超净台超净台思考题：思考题：A A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1 1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌3030分钟。分钟。2 2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3 3、整个操作在酒精灯火焰旁进行、整个操作在酒精灯火焰旁进行4 4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。B B、培养基灭菌后，需要冷却到、培养基灭菌后，需
16、要冷却到6060后才倒平板，你后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。思考题思考题C C、为何要将平板倒置？、为何要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上
17、的水珠落培养基，造成污染。落培养基，造成污染。DD、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。E E、如何检查培养基是否受杂菌的污染？、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污
18、染。则未受杂菌污染。（二）液体培养基接种培养（二）液体培养基接种培养主要器具：主要器具：操作方法：操作方法：先将接种环进行先将接种环进行_灭菌灭菌,_,_后后的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基中，加塞。置于中，加塞。置于_摇床振荡培养小时。摇床振荡培养小时。无菌操作：无菌操作：略略摇床摇床思考：如何冷却接种环？思考：如何冷却接种环？可通过接触试管内壁或未可通过接触试管内壁或未长菌的培养基达到冷却的长菌的培养基达到冷却的目的。目的。接种环、摇床等接种环、摇床等灼烧灼烧冷却冷却（三）平板划线分离法（三）平板划线分离法主要器具：主要器具：操作过程
19、：操作过程：注意：注意：无菌操作方法：同前。无菌操作方法：同前。将培养皿将培养皿_（盖在下），放于（盖在下），放于_恒温培养恒温培养箱中培养箱中培养_小时。小时。在作第二次以及其后的划线操作时，要从在作第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的开始上一次划线的开始_划线。划线。接种环、接种环、思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总共进行几次灼烧灭菌？共进行几次灼烧灭菌？恒温培养箱。恒温培养箱。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。末端末端倒置倒置 平板划线的操作方法平板划线的操作方法交叉划线法交叉划线法连续划
20、线法连续划线法 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？接种环？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，
21、以便得到单个菌落。菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。2 2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？为什么？划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。3.3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。4.4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开
22、始划线？上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。殖而来的菌落。5 5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？、如何判断接种操作是否符合无菌要求？如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是
23、符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。接种过程中，无菌操作还未达到要求。（四）（四）稀释涂布平板法稀释涂布平板法主要器具：主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管玻璃三角刮刀、移液管或吸管操作过程：操作过程：先将培养菌液先将培养菌液稀释稀释（1010-5-51010-7-7倍）倍）用移液管或吸管取用移液管或吸管取0.1ml0.1ml稀释度不同的菌液，加稀释度不同的菌液，加在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养基平面上。基平面上。在适当稀释度下在适当稀释度下，可培养得
24、到相互分，可培养得到相互分开的的菌落。开的的菌落。将培养皿倒置（盖在下），放于将培养皿倒置（盖在下），放于 恒温培养恒温培养箱中培养小时。箱中培养小时。划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，但操作复杂些。但操作复杂些。10g10g土样土样从土壤中分离微生物从土壤中分离微生物稀释涂布法稀释涂布法（五）斜面接种及菌种保存（五）斜面接种及菌种保存主要器具主要器具：操作过程操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取：在无菌操作下，用接种环挑取_菌落，菌落，再用划线法再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种接种在在_上，上，_ _恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养
25、_小时小时后，后，_ _ 冰箱保存。冰箱保存。无菌操作无菌操作：同前：同前试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。思考：菌种保存为何采思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？用斜面而不是平板？接种环、恒温箱、冰箱接种环、恒温箱、冰箱单单斜面斜面菌种的保存菌种的保存菌种的保存菌种的保存 1 1、临时保藏：、临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法思考题
26、？n利用培养基技术不仅可以分离微生物，也可利用培养基技术不仅可以分离微生物，也可以进行植物组织培养。请简要说明这两项技以进行植物组织培养。请简要说明这两项技术应用设计思路的相同点以及区别。术应用设计思路的相同点以及区别。相同点：都是从培养对象所需的营养条件出发，相同点：都是从培养对象所需的营养条件出发，配置适宜培养基。都要求严格的无菌条件。配置适宜培养基。都要求严格的无菌条件。不同点：植物组织培养往往还要加入激素。不同点：植物组织培养往往还要加入激素。超净工作台超净工作台紫外灯紫外灯过滤风过滤风实验一实验一 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离实验步骤：实验步骤：一一 配制配制LBLB培养基培养基溶解溶解计算称量计算称量调调pHpH分装分装加塞，包扎加塞，包扎灭菌灭菌二二 倒平板、制斜面倒平板、制斜面三三 大肠杆菌的培养大肠杆菌的培养三三 大肠杆菌的分离大肠杆菌的分离平板划线分离法（或稀释涂布平板法）平板划线分离法（或稀释涂布平板法）使所需细菌大量繁殖使所需细菌大量繁殖获得单菌落，纯化菌株获得单菌落，纯化菌株四四 斜面接种培养斜面接种培养目的菌株的纯培养和菌种保存目的菌株的纯培养和菌种保存