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1、实验八动物细胞融合 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、实验目的一、实验目的 了解细胞融合的原理了解细胞融合的原理了解细胞融合的原理了解细胞融合的原理 初步掌握聚乙二醇法诱导细胞融合的实验初步掌握聚乙二醇法诱导细胞融合的实验初步掌握聚乙二醇法诱导细胞融合的实验初步掌握聚乙二醇法诱导细胞融合的实验 方法。方法。方法。方法。二、实验原理二、实验原理 细胞融合细胞融合又称体细胞杂交是指在自然条又称体细胞杂交是指在自然条件或利用人工方法（生物的、物理的，化学
2、件或利用人工方法（生物的、物理的，化学的），使两个或两个以上的细胞合并成一个的），使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。利用人工诱导具有双核或多核细胞的过程。利用人工诱导方法，不仅可以使同种细胞发生融合，而且方法，不仅可以使同种细胞发生融合，而且可以使不同种间细胞发生融合。可以使不同种间细胞发生融合。n种内杂交细胞种内杂交细胞（intraspecific hybrid cell）:同种细胞融合而成的细胞同种细胞融合而成的细胞n种间杂交细胞（种间杂交细胞（interspecific hybrid cell）:不同种的细胞融合而成的细胞不同种的细胞融合而成的细胞人工诱导细胞融合
3、 病毒诱导融合病毒诱导融合 化学诱导融合化学诱导融合 电激诱导融合电激诱导融合1、病毒诱导融合n n很多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、很多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、很多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、很多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒等。牛痘病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒等。牛痘病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒等。牛痘病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒等。n n这类病毒的被膜中有融合蛋白（这类病毒的被膜中有融合蛋白（这类病毒的被膜中有融合蛋白（这类病毒的被膜中有融合蛋白（fusion fusion proteinprotein），可介导病毒
4、同宿主细胞融合，也），可介导病毒同宿主细胞融合，也），可介导病毒同宿主细胞融合，也），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。灭活的此类病毒诱导细胞融合。灭活的此类病毒诱导细胞融合。灭活的此类病毒诱导细胞融合。n n融合率较高，对各种动物细胞都适宜。但是病融合率较高，对各种动物细胞都适宜。但是病融合率较高，对各种动物细胞都适宜。但是病融合率较高，对各种动物细胞都适宜。但是病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并毒不稳定
5、，在保存过程中融合活性会降低，并毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。可能会对细胞的生命活动产生干扰。可能会对细胞的生命活动产生干扰。可能会对细胞的生命活动产生干扰。2、化学诱导融合n n很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（乙二醇（PEGPEG）、二甲亚砜、山梨醇、甘）、二甲亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷酸酰丝
6、氨酸等。油、溶血性卵磷脂、磷酸酰丝氨酸等。n n这类物质导致细胞膜脂分子排列的改变，这类物质导致细胞膜脂分子排列的改变，在去除作用因素之后，质膜恢复原有的在去除作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中由于接口处双有序结构，在恢复过程中由于接口处双分子层质膜的相互亲合和表面张力，使分子层质膜的相互亲合和表面张力，使相接触的细胞发生融合。相接触的细胞发生融合。n n使用方便，诱导细胞融合的频率比较高，使用方便，诱导细胞融合的频率比较高，效果稳定，适用于动植物，但是具有毒效果稳定，适用于动植物，但是具有毒性。性。3、电脉冲诱导融合n n发展于发展于2020世纪世纪8080年代，年代，在高频
7、交变电场作在高频交变电场作用下用下,细胞发生极化作用形成偶极子细胞发生极化作用形成偶极子,受受电场力的作用进而沿电力线方向运动彼此电场力的作用进而沿电力线方向运动彼此粘连成串粘连成串;对成串细胞施加瞬时高压脉冲对成串细胞施加瞬时高压脉冲,质膜在高电压作用下发生瞬时可逆性的电质膜在高电压作用下发生瞬时可逆性的电穿孔穿孔,进而发生细胞的融合。进而发生细胞的融合。n n具有融合频率高、无毒性、作用机制明确、具有融合频率高、无毒性、作用机制明确、可重复性好等优点。难控制一对细胞间的可重复性好等优点。难控制一对细胞间的融合。融合。4、激光诱导融合、激光诱导融合n利用激光俘虏法或者低浓度的融合剂利用激光俘
8、虏法或者低浓度的融合剂PEG(5%)发使细胞聚集，然后利用激光微束可发使细胞聚集，然后利用激光微束可以对相邻细胞的接触区细胞进行破坏以对相邻细胞的接触区细胞进行破坏,从而从而诱导许多细胞中所需的两个相邻细胞融合。诱导许多细胞中所需的两个相邻细胞融合。n n具有控制性好、融合频率高、无毒性、作具有控制性好、融合频率高、无毒性、作用机制明确、可重复性好等优点。用机制明确、可重复性好等优点。聚乙二醇（聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）法的原）法的原理：理：PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由胞接触点
9、处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲合以及彼于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲合以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。此的表面张力作用，使细胞发生融合。n n无色无臭粘稠液体至蜡状固体。溶于水、无色无臭粘稠液体至蜡状固体。溶于水、乙醇和许多其他有机溶剂，具有良好的乙醇和许多其他有机溶剂，具有良好的水水溶性溶性,无毒、无刺激性无毒、无刺激性.n n品种多，聚乙二醇聚乙二醇300(PEG300)、聚乙二醇、聚乙二醇600(PEG600)、聚乙二醇、聚乙二醇20 000(PEG20M)，PEG后面数字表示平均分子量后面数字表示平均分子量,在医药、纺在医药、纺织、化妆
10、品工业中织、化妆品工业中 广泛应用广泛应用动物细胞融合动物细胞融合影响因素影响因素 动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合中中中中，除除除除促促促促融融融融剂剂剂剂外外外外，其其其其他他他他如如如如细细细细胞胞胞胞性性性性质质质质、温温温温度度度度、pHpHpHpH、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。n n亲本细胞表面性质影响较大亲本细胞表面性质影响较大亲本细胞表面性质影响较大亲本细胞表面性质影响较大n n细细细细胞胞胞胞种种种种类类类类不不不不
11、同同同同，融融融融合合合合效效效效果果果果也也也也不不不不同同同同，如如如如腹腹腹腹水水水水癌癌癌癌及及及及株株株株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。n n细胞融合时需要适宜温度和运动状态。细胞融合时需要适宜温度和运动状态。细胞融合时需要适宜温度和运动状态。细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如如如如仙仙仙仙台台台台病病病病毒毒毒毒诱诱诱诱导导导导-腹腹腹腹水水水水癌癌癌癌细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合时时时时，于于于于37 37 37
12、37 振振振振摇摇摇摇时时时时易易易易于于于于融融融融合合合合，且且且且融融融融合合合合效效效效率率率率与与与与病病病病毒毒毒毒量量量量呈呈呈呈正正正正比比比比。但但但但在在在在34343434振振振振摇摇摇摇则则则则融融融融合合合合率下降。在率下降。在率下降。在率下降。在37373737时不振摇则时不振摇则时不振摇则时不振摇则-不融合。不融合。不融合。不融合。n n细细胞胞融融合合过过程程中中，通通通通常常常常耗耗耗耗氧氧氧氧量量量量较较较较大大大大，缺缺氧氧时时经经常常不不融融合合。空空气气中中含含氧氧量量大大于于2020时时有有一一定定融融合合率，但有些细胞在无氧条件也可融合。率，但有些
13、细胞在无氧条件也可融合。n n有有有有些些些些细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合时时时时需需需需要要要要CaCaCaCa2+2+2+2+，否否否否则则则则不不不不融融融融合合合合，细细胞胞蛋蛋白质亦发生变化。白质亦发生变化。实实验验表表明明SrSr2+2+、BaBa2+2+、MgMg2+2+、MnMn2+2+等等离离子子可可代代替替CaCa2+2+，但但有有效效浓浓度度较较CaCa2+2+大大的的多多。融融合合时时最最适适合合的的离离子子强强度度一一般般为为0.1mol/L0.1mol/L。n n最最最最适适适适合合合合的的的的pHpHpHpH为为为为7.4-7.87.4-7.87.4-7.87
14、.4-7.8之之之之间间间间，在在此此范范围围之之外外，融融合率均较低。合率均较低。n n细胞融合成功的关键：细胞活力、离子浓细胞融合成功的关键：细胞活力、离子浓度、度、pH值、充足的氧和适当的诱导物等。值、充足的氧和适当的诱导物等。三、细胞融合的应用n n动物和植物的不同种、属之间的细胞可动物和植物的不同种、属之间的细胞可以融合，并且动植物之间的细胞可以融以融合，并且动植物之间的细胞可以融合，从而培养成各种性状的杂种细胞。合，从而培养成各种性状的杂种细胞。细胞融合被广泛应用于研究核质关系、细胞融合被广泛应用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体
15、、研究肿瘤发生机制等领域。研究肿瘤发生机制等领域。四、实验材料、设备n n鸡血红细胞悬液、鸡血红细胞悬液、鸡血红细胞悬液、鸡血红细胞悬液、GKNGKN溶液、溶液、溶液、溶液、0.850.85生理盐水、生理盐水、生理盐水、生理盐水、5050PEGPEG溶液、溶液、溶液、溶液、0.6M0.6M蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液n n光学显微镜、离心机、恒温水浴锅、载玻片、光学显微镜、离心机、恒温水浴锅、载玻片、光学显微镜、离心机、恒温水浴锅、载玻片、光学显微镜、离心机、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、移液器、离心管、吸管等盖玻片、移液器、离心管、吸管等盖玻片、移液器、离心管、吸管等盖玻片、移液器、离心管
16、、吸管等n nGKNGKN溶液溶液溶液溶液:8gNaCl+0.4g KCL+1.77g:8gNaCl+0.4g KCL+1.77g NaHNaH2 2POPO4 4.2H.2H2 2O+0.69g NaO+0.69g Na2 2HPOHPO4 4.12H.12H2 2O+2gO+2g葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+0.01g+0.01g酚红，加水至酚红，加水至酚红，加水至酚红，加水至1000ml1000ml本实验材料为鸡红细胞，其核结构紧密，易于观察。本实验材料为鸡红细胞，其核结构紧密，易于观察。本实验材料为鸡红细胞，其核结构紧密，易于观察。本实验材料为鸡红细胞，其核结构紧密，易于观察。PEG 融合
17、实验步骤鸡红血球的洗涤鸡红血球的洗涤鸡红血球的洗涤鸡红血球的洗涤：每人取用每人取用每人取用每人取用0.9%0.9%生理盐水稀释生理盐水稀释生理盐水稀释生理盐水稀释100100倍的鸡血倍的鸡血倍的鸡血倍的鸡血1ml1ml于于于于1 1支支支支EpEp管中，以管中，以管中，以管中，以1000r/min1000r/min离心离心离心离心3min3min，去上清；再依，去上清；再依，去上清；再依，去上清；再依次用次用次用次用1ml1ml生理盐水和生理盐水和生理盐水和生理盐水和1ml GKN1ml GKN溶液各洗一遍（洗涤溶液各洗一遍（洗涤溶液各洗一遍（洗涤溶液各洗一遍（洗涤离心）加离心）加离心）加离心
18、）加0.5mlGKN0.5mlGKN悬浮悬浮悬浮悬浮细胞（细胞（细胞（细胞（10-1210-12滴）。滴）。滴）。滴）。37 37 水浴锅中温育水浴锅中温育水浴锅中温育水浴锅中温育5min5min。PEG(PEG(含含含含5mM CaCl5mM CaCl2 2)温育温育温育温育：再再再再缓慢滴加缓慢滴加缓慢滴加缓慢滴加预热的预热的预热的预热的5050PEG 0.25mlPEG 0.25ml，边加边混匀边加边混匀边加边混匀边加边混匀,于于于于3737水浴锅中温育水浴锅中温育水浴锅中温育水浴锅中温育20min20min。洗涤细胞：洗涤细胞：洗涤细胞：洗涤细胞：加加加加GKNGKN溶液溶液溶液溶液1
19、.0ml1.0ml稀释稀释稀释稀释,以以以以1000r/min1000r/min离心离心离心离心3min 3min，去上清，再用，去上清，再用，去上清，再用，去上清，再用0.5ml GKN0.5ml GKN溶液重悬细胞溶液重悬细胞溶液重悬细胞溶液重悬细胞观察：滴片观察：滴片观察：滴片观察：滴片(上盖玻片上盖玻片上盖玻片上盖玻片)，显微镜观察，画图。，显微镜观察，画图。，显微镜观察，画图。，显微镜观察，画图。1.1.在显微镜下观察细胞融合情况，可看到不同在显微镜下观察细胞融合情况，可看到不同融合状态的细胞：两细胞的细胞膜间相互接触、融合状态的细胞：两细胞的细胞膜间相互接触、粘连；接触部位的细胞膜
20、崩解，两细胞间的细胞粘连；接触部位的细胞膜崩解，两细胞间的细胞质相通，形成细胞质通道；通道扩大，两个细胞质相通，形成细胞质通道；通道扩大，两个细胞连成一体；细胞合并完成，形成一个含有两个或连成一体；细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。多个核的圆形细胞。实验结果及分析实验结果及分析 注意事项注意事项 1.1.滴加滴加5050PEGPEG时，应缓慢、逐滴加入，而且每时，应缓慢、逐滴加入，而且每 加一滴应轻摇离心管以混匀，滴加完毕后可用加一滴应轻摇离心管以混匀，滴加完毕后可用 滴管温和混匀。滴管温和混匀。2.2.高高CaCa2+2+浓度能提高细胞的融合率。浓度能提高细胞的融合率。3.3.因因PEGPEG对细胞有毒性，应严格控制作用时间为对细胞有毒性，应严格控制作用时间为1-1-2 2分钟，但本实验中融合后的细胞不继续培养，可将分钟，但本实验中融合后的细胞不继续培养，可将处理时间延长至处理时间延长至15min15min以达到最高融合率。以达到最高融合率。4.4.细胞融合对温度很敏感，过高过低的温度均不细胞融合对温度很敏感，过高过低的温度均不利于融合。实验最佳温度应控制在利于融合。实验最佳温度应控制在37373939范围范围内。内。作业作业绘细胞融合过程图。绘细胞融合过程图。