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1、三维设计高中生物选修-第一讲-基因工程(徐州-生物杜老师)剖析知知识识内容内容等级要求等级要求1基因工程的基因工程的诞诞生生A2基因工程的原理及技基因工程的原理及技术术A3基因工程的基因工程的应应用用B4蛋白蛋白质质工程工程A5DNA的粗提取与的粗提取与鉴鉴定定b1.基因工程的工具基因工程的工具(1)DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNA连连接接酶酶DNA聚合聚合酶酶作用作用实质实质都是催化两个核苷酸之都是催化两个核苷酸之间间形成磷酸二形成磷酸二酯键酯键是否需模板是否需模板不需要不需要需要需要连连接接DNA链链双双链链单链单链作用作用过过程程在两个在两个DNA片段之片段之间
2、间形形成磷酸二成磷酸二酯键酯键将将单单个核苷酸加到已存个核苷酸加到已存在的核酸片段的在的核酸片段的3端的端的羟羟基上，形成磷酸二基上，形成磷酸二酯酯键键作用作用结结果果将存在的将存在的DNA片段片段连连接接成重成重组组DNA分子分子合成新的合成新的DNA分子分子(2)载体载体具备条件：具备条件：a对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。b具标记基因。能对重组具标记基因。能对重组DNA是否进入受体细胞进行鉴是否进入受体细胞进行鉴定。定。c能自我复制。通过复制进行基因扩增，否则可能会使能自我复制。通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组重组DNA丢
3、失。丢失。d具有一个或多个限制酶切点，供外源基因插入其中。具有一个或多个限制酶切点，供外源基因插入其中。常用载体常用载体质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌染色质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌染色体体DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。分子。2.基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序(1)目的基因的获取途径目的基因的获取途径直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。库中获取。人工合成目的基因人工合成目的基因常用的方法有：常用的方法有：a已知核苷酸序列的较小基因，直接利用已知核苷酸
4、序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用合成仪用化学方法合成，不需要模板。化学方法合成，不需要模板。b以以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。为模板，在逆转录酶作用下人工合成。c利用利用PCR技术获得。技术获得。PCR技术与技术与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理DNA双链复制双链复制(碱基互补配对碱基互补配对)原料原料四种游离的脱氧核苷酸四种游离的脱氧核苷酸条件条件模板、酶等模板、酶等PCR技术技术DNA复制复制不不同同点点解旋方式解旋方式DNA在高温在高温下变性解旋下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化场所场所体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内酶
5、酶热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶(TaqTaq酶酶)细胞内含有的细胞内含有的DNA聚合酶聚合酶结果结果在短时间内形在短时间内形成大量的成大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子(2)基因表达载体的构建基因表达载体的构建重组质粒的构建重组质粒的构建 表达载体的组成：目的基因表达载体的组成：目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因。标记基因。基因表达载体的构建基因表达载体的构建(3)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化受体种类不同，受体种类不同，导入方法不同导入方法不同植物：农杆菌转化法、基因植物：农杆菌转化法、基因 枪法、花粉管通道法枪法、花粉管通道法动物：显
6、微注射法动物：显微注射法微生物：感受态细胞法微生物：感受态细胞法受体种类不同，所用的受体细胞种类也不相同。受体种类不同，所用的受体细胞种类也不相同。植物：可以是卵细胞植物：可以是卵细胞(受精卵受精卵)、体细胞、体细胞(可经组织培养可经组织培养成为完整个体成为完整个体)。动物：受精卵动物：受精卵(因为体细胞的全能性受到限制因为体细胞的全能性受到限制)。转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。(4)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定导入检测：导入检测：DNA分子杂交法分子杂交法(使用使用DNA探针探针)。表达检测表达检测转录检测：分子杂
7、交法检测转录检测：分子杂交法检测mRNA翻译检测：免疫法，提取蛋白质用相翻译检测：免疫法，提取蛋白质用相 应的抗体进行抗体应的抗体进行抗体抗原杂交抗原杂交个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或 抗病等的接种实验。抗病等的接种实验。切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得 相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序 列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后列，
8、因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后 须有终止子。须有终止子。在整个工程中，只有第三步将目的基因导入受体细胞过在整个工程中，只有第三步将目的基因导入受体细胞过 程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生配对。程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生配对。3基因工程的应用基因工程的应用(1)乳腺生物反应器与微生物生产的比较乳腺生物反应器与微生物生产的比较类类型型项项目目乳腺生物反乳腺生物反应应器器微生物生微生物生产产基因基因结结构构动动物基因物基因结结构与人构与人类类基因基因结结构相同构相同与人与人类类基因基因结结构不同构不同基因表达基因表达与天然蛋白与天然蛋白质质活性活性没有区没有区别别由于
9、缺少内由于缺少内质质网、高网、高尔尔基体等基体等细细胞器，胞器，产产物可物可能不具有生物活性能不具有生物活性产产物提取物提取从乳汁中从乳汁中较较易分离易分离提取提取从从细细胞中提取，胞中提取，较为较为复复杂杂生生产设备产设备畜牧畜牧业业生生产产，加提，加提取取设备设备工工业业生生产产，设备设备精良精良 乳腺生物反应器受生物性别的限制，若从动物尿乳腺生物反应器受生物性别的限制，若从动物尿液中提取目的基因产物则不受性别限制。液中提取目的基因产物则不受性别限制。(2)基因治疗基因治疗项项目目类类型型外源基因外源基因类类型及型及举举例例过过程程特点特点成果成果举举例例体外体外基因基因治治疗疗腺苷酸脱腺
10、苷酸脱氨氨酶酶基因基因从病人体内从病人体内获获得某得某 种种细细胞胞细细胞培养胞培养体外完成基因体外完成基因转转移移筛选筛选并并扩扩增培养增培养 重新重新输输入患者体内入患者体内操作操作复复杂杂，但，但成功成功率高率高治治疗疗复复合型免合型免疫缺陷疫缺陷症症项项目目类类型型外源基因外源基因类类型及型及举举例例过过程程特点特点成果成果举举例例体内基体内基因治因治疗疗治治疗遗传疗遗传性囊性囊性性纤维纤维化病的化病的基因基因外源基因外源基因载载体携体携带带 体内相体内相应组织应组织细细胞胞操作操作简简单单，成，成功率低功率低治治疗疗遗传遗传性囊性囊性性纤纤维维化化病病转转移移(2010温州质检温州质
11、检)下表为几种限制性核酸内切酶识别的序列下表为几种限制性核酸内切酶识别的序列和切割的位点。如下图，已知某和切割的位点。如下图，已知某DNA在目的基因的两端在目的基因的两端1、2、3、4四处有四处有BamHI或或EcoRI或或PstI的酶切位点。现用的酶切位点。现用BamHI和和EcoRI两种酶同时切割该两种酶同时切割该DNA片段片段(假设所用的酶均假设所用的酶均可将识别位点完全切开可将识别位点完全切开)，下列各种酶切位点情况中，可以，下列各种酶切位点情况中，可以防止酶切后单个含目的基因的防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状的片段自身连接成环状的是是 ()1.限制限制酶酶BamH
12、IEcoR IPst I识别识别序列和切序列和切割位点割位点 GGATCC CCTAGG GAATTC CTTAAG CTGCAG GACGTC A1 为为BamH，2为为EcoR，3为为BamH，4为为PstB1为为EcoR，2为为BamH，3为为BamH，4为为PstC1为为Pst，2为为EcoR，3为为EcoR，4为为BamHD1为为BamH，2为为EcoR，3为为Pst，4为为EcoR解析：解析：只用只用BamH和和EcoR两种酶同时切割该两种酶同时切割该DNA片段，要片段，要想防止酶切后单个含目的基因的想防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状，片段自身连接成环状，只要目的
13、基因两端只要目的基因两端2与与3的限制酶为的限制酶为BamH或或EcoR即可。即可。答案：答案：A2.下下图图是利用基因工程技是利用基因工程技术术生生产产人胰人胰岛岛素的操作素的操作过过程示意程示意 图图，请请据据图图作答。作答。(1)图中基因工程的基本过程可以概括为图中基因工程的基本过程可以概括为“四步曲四步曲”：即：即；。(2)能否利用人的皮肤细胞来完成能否利用人的皮肤细胞来完成过程？过程？，为什么，为什么？。(3)过程过程必需的酶是必需的酶是酶，过程酶，过程必需的酶是必需的酶是 酶。酶。(4)若若A中共有中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，是个，是过程过程连续进行连
14、续进行4次，至少需提供胸腺嘧啶次，至少需提供胸腺嘧啶个。个。(5)在利用在利用AB获得获得C的过程中，必须用的过程中，必须用切割切割A和和B，使它们产生，使它们产生，再加入，再加入，才可，才可形成形成C。(6)为使过程为使过程更易进行，可用更易进行，可用(药剂药剂)处理处理D。解析：解析：图中图中过程是从细胞中获取相应的过程是从细胞中获取相应的mRNA，由于基因，由于基因的选择性表达，人的皮肤细胞中的胰岛素基因不表达，不转的选择性表达，人的皮肤细胞中的胰岛素基因不表达，不转录，因此不能形成胰岛素录，因此不能形成胰岛素mRNA。从。从mRNADNA是逆转录的是逆转录的过程，需要逆转录酶。过程，需
15、要逆转录酶。DNA分子的扩增须用解旋酶将双链分子的扩增须用解旋酶将双链DNA解旋为单链。一个解旋为单链。一个DNA分子中的鸟嘌呤分子中的鸟嘌呤(b个个)和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶之和占碱基总数之和占碱基总数(2a个个)的一半，所以该一个的一半，所以该一个DNA分子片段中分子片段中胸腺嘧啶数为胸腺嘧啶数为(ab)个。连续复制个。连续复制4次，共产生次，共产生DNA分子分子2416个，由于复制方式为半保留复制，故需要提供的胸腺嘧啶个，由于复制方式为半保留复制，故需要提供的胸腺嘧啶数量为数量为(ab)(161)15(ab)。构建基因表达载体时需。构建基因表达载体时需将目的基因与运载体用同一种限制酶切割，产
16、生相同的黏性将目的基因与运载体用同一种限制酶切割，产生相同的黏性末端，才可以在末端，才可以在DNA连接酶的作用下连接形成基因表达载体。连接酶的作用下连接形成基因表达载体。将目的基因导入细菌，常用将目的基因导入细菌，常用Ca2处理细菌，使其变为感受态处理细菌，使其变为感受态细菌，可吸收含目的基因的运载体进入细菌细胞内。细菌，可吸收含目的基因的运载体进入细菌细胞内。答案：答案：(1)获取目的基因构建基因表达载体将目的基因获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定导入受体细胞目的基因的检测与鉴定(2)不能皮肤细不能皮肤细胞中的胰岛素基因未表达胞中的胰岛素基因未表达(或未转
17、录或未转录)，不能形成胰岛素，不能形成胰岛素mRNA(3)逆转录解旋逆转录解旋(4)15(ab)(5)同一种限制核同一种限制核酸性内切酶相同的黏性末端酸性内切酶相同的黏性末端DNA连接酶连接酶(6)CaCl2(或答或答Ca2)项项目目蛋白蛋白质质工程工程基因工程基因工程区区别别过过程程预预期蛋白期蛋白质质功能功能设计设计蛋蛋白白质结质结构构推推测测氨基酸序氨基酸序列列推推测测脱氧核苷酸序列脱氧核苷酸序列合成合成DNA表达出蛋表达出蛋白白质质获获取目的基因取目的基因构建表构建表达达载载体体导导入受体入受体细细胞胞目的基因的目的基因的检测检测与与鉴鉴定定实质实质定向改造或生定向改造或生产产人人类类
18、所需所需蛋白蛋白质质定向改造生物的定向改造生物的遗传遗传特特性，以性，以获获得人得人类类所需的所需的生物生物类类型或生物型或生物产产品品(基因的异体表达基因的异体表达)结结果果 生生产产自然界没有的蛋白自然界没有的蛋白质质生生产产自然界中已有的蛋自然界中已有的蛋白白质质项项目目蛋白蛋白质质工程工程基因工程基因工程联联系系蛋白蛋白质质工程是在基因工程的基工程是在基因工程的基础础上，延伸出来上，延伸出来的第二代基因工程。因的第二代基因工程。因为对现为对现有蛋白有蛋白质质的改造的改造或制造新的蛋白或制造新的蛋白质质，必，必须须通通过过基因修基因修饰饰或基因或基因合成合成实现实现 由于密码子具有由于密
19、码子具有“简并性简并性”，故由某种特定氨基，故由某种特定氨基酸序列所推测出的脱氧核苷酸序列可有多种，即逆推所酸序列所推测出的脱氧核苷酸序列可有多种，即逆推所得的基因可有多种。得的基因可有多种。下列关于基因工程的叙述，错误的是下列关于基因工程的叙述，错误的是 ()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶连接酶是两类常用的工具酶 C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性物活性 D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有
20、利于筛选含重组DNA的细胞和促的细胞和促进目的基因的表达进目的基因的表达 解析解析目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；基因工程中常用的工具酶有限制性核酸内切酶和物；基因工程中常用的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶；大肠杆菌为原核生物，不含有内质网和高尔基体连接酶；大肠杆菌为原核生物，不含有内质网和高尔基体等细胞器，不能对蛋白质进行加工，其合成的胰岛素原无等细胞器，不能对蛋白质进行加工，其合成的胰岛素原无生物活性。载体中的抗性基因为标记基因，其作用是有利生物活性。载体中的抗性基因为标记基因，其作用是有利于筛选含重组于筛选含重组DNA的细胞，不
21、能促进目的基因的表达。的细胞，不能促进目的基因的表达。答案答案D 苏云金杆菌苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗为抗氨苄青霉素基因氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。，据图回答下列问题。(1)将图中将图中的的DNA用用Hind、BamH完全酶切后，反完全酶切后，反应管中有应管中有_种种DNA片段。片段。(2)图中图中表示表示Hind与与BamH酶切、酶切、DNA连接酶连接连接酶连接的过程，此过程可获得的过程，此过程可获得_种重组质粒；如果换用种重组质粒；如
22、果换用Bst与与BamH酶切，目的基因与质粒连接后可获得酶切，目的基因与质粒连接后可获得_种重组质粒。种重组质粒。(3)目的基因插入质粒后，不能影响质粒的目的基因插入质粒后，不能影响质粒的_。(4)图中图中的的Ti质粒调控合成的质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目蛋白，可以协助带有目的基因的的基因的TDNA导入植物细胞，并防止植物细胞中导入植物细胞，并防止植物细胞中_对对TDNA的降解。的降解。(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆
23、虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞胞_。(6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的其目的是降低害虫种群中的_基因频率的增长速率。基因频率的增长速率。解析解析(1)BamH 在在中有中有2个切点，个切点，Hind在在中中有有1个切点，故可切出个切点，故可切出4种种DNA片段。片段。(2)因因Hind切出的末端切出的末端与与Bam H切出的末端不同，则重组的质粒有切出的末端不同，则重组的质粒有2种。种。(3)质粒质粒进入宿主细胞必须能正
24、常复制才能为目的基因的扩增提供必进入宿主细胞必须能正常复制才能为目的基因的扩增提供必要的条件。要的条件。(4)植物细胞中有能降解植物细胞中有能降解TDNA的酶的酶(DNA水解酶水解酶)。(5)不同生物的基因不同，表达产物的蛋白质也不同。从而造不同生物的基因不同，表达产物的蛋白质也不同。从而造成人类肠上皮细胞表面无相应毒素蛋白的受体。成人类肠上皮细胞表面无相应毒素蛋白的受体。(6)转基因与转基因与非转基因作物混种，可降低抗性作物对害虫的选择性，使害非转基因作物混种，可降低抗性作物对害虫的选择性，使害虫种群中的抗性基因频率增长速率减慢。虫种群中的抗性基因频率增长速率减慢。答案答案(1)4 (2)2
25、1 (3)复制复制 (4)DNA水解酶水解酶(5)表面无相应的特异性受体表面无相应的特异性受体 (6)抗性抗性基因工程与蛋白质工程的理论基础基因工程与蛋白质工程的理论基础(1)基因拼接的理论基础基因拼接的理论基础DNA是生物的主要遗传物质。是生物的主要遗传物质。DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。双链双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(2)外源基因在受体内表达的理论基础外源基因在受体内表达的理论基础基因是控制生物性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。遗传信息的传递都遵循中心法则的信息流动方向。
26、遗传信息的传递都遵循中心法则的信息流动方向。生物界共用一套遗传密码。生物界共用一套遗传密码。天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：列问题：(1)将淀粉酶基因切割下来所用的工具是将淀粉酶基因切割下来所用的工具是_，用，用_将淀粉酶基因与载体
27、拼接成新将淀粉酶基因与载体拼接成新的的DNA分子，下一步将该分子，下一步将该DNA分子分子_，以完成工程菌的构建。以完成工程菌的构建。(2)若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检测方法是的检测方法是_；若要鉴定淀粉酶基因是；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用否翻译成淀粉酶，可采用_检测；将该工检测；将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一定时间后，程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一定时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈。请解释该现象发生的加入碘液，工程菌周围出现透明圈。请解释该现象发生的原因。原因。_。(3)如何进
28、一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉如何进一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小？能力的大小？_。(4)微生物在基因工程领域中有哪些重要作用？微生物在基因工程领域中有哪些重要作用？_。解析解析该工程菌的构建包括目的基因的获取，基因该工程菌的构建包括目的基因的获取，基因表达载体的构建和导入以及目的基因的检测与鉴定等步骤，表达载体的构建和导入以及目的基因的检测与鉴定等步骤，相同条件下淀粉酶的活性或酒精产量可反映出该菌利用淀相同条件下淀粉酶的活性或酒精产量可反映出该菌利用淀粉能力的大小。粉能力的大小。答案答案(1)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA连接酶导入酿连接酶导入酿酒酵母菌酒酵
29、母菌 (2)DNA分子杂交抗原抗体杂交或淀粉酶活性该分子杂交抗原抗体杂交或淀粉酶活性该工程菌产生的淀粉酶可分泌至培养基，水解淀粉后的区域，工程菌产生的淀粉酶可分泌至培养基，水解淀粉后的区域，遇碘不再变蓝色，产生透明圈遇碘不再变蓝色，产生透明圈 (3)测定相同培养条件下不同工程菌菌株的淀粉酶活性测定相同培养条件下不同工程菌菌株的淀粉酶活性或酒精产量或酒精产量 (4)工具酶主要来自微生物；工具酶主要来自微生物；最重要的目的基因最重要的目的基因供体库之一；供体库之一；目的基因的载体之一；目的基因的载体之一；作为受体细胞；作为受体细胞；提供用于发酵的工程菌提供用于发酵的工程菌(1)DNA在不同浓度氯化
30、钠溶液中的溶解度不同，其变化在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度不同，其变化曲线为：曲线为：(2)DNA不溶于酒精溶液，但细不溶于酒精溶液，但细 胞中的其他某些物质可以溶胞中的其他某些物质可以溶 于酒精溶液，据此可提取含杂质较少的于酒精溶液，据此可提取含杂质较少的DNA。(3)DNA二苯胺二苯胺 蓝色蓝色(用于用于DNA的鉴定的鉴定)。本讲实验本讲实验DNA的粗提取与的粗提取与鉴鉴定定沸水浴沸水浴(1)选鸡血作实验材料的原因选鸡血作实验材料的原因鸡血经济且易制得，鸡血红细胞、白细胞都具有细胞鸡血经济且易制得，鸡血红细胞、白细胞都具有细胞核，含大量核，含大量DNA。哺乳动物的红细胞没有细胞核，。哺乳动
31、物的红细胞没有细胞核，DNA含量较低，因而不宜作实验材料。含量较低，因而不宜作实验材料。(2)制备鸡血细胞液的方法制备鸡血细胞液的方法 鸡血柠檬酸钠鸡血柠檬酸钠用离心机离心，血细胞沉淀于底部用离心机离心，血细胞沉淀于底部放冰箱内静置，血细胞沉淀于底部放冰箱内静置，血细胞沉淀于底部(3)实验中三次加实验中三次加NaCl溶液溶液在步骤在步骤2中，加入中，加入NaCl溶液后必须充分搅拌，加速染色溶液后必须充分搅拌，加速染色质中质中DNA与蛋白质分离，使与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在充分游离并溶解在NaCl溶溶液中。液中。在步骤在步骤5中，加中，加NaCl溶液的目的是使溶液的目的是使DNA再溶
32、解，这时再溶解，这时溶液中蛋白质含量已很少。溶液中蛋白质含量已很少。在步骤在步骤8中，加中，加NaCl溶液的浓度比前两次低得多，但目溶液的浓度比前两次低得多，但目的还是溶解的还是溶解DNA。(4)实验中三次过滤实验中三次过滤步骤步骤1中将鸡血细胞液进行过滤，取得的滤液中含有染中将鸡血细胞液进行过滤，取得的滤液中含有染色质，而滤出的是细胞膜、核膜和细胞器等的破碎结构。色质，而滤出的是细胞膜、核膜和细胞器等的破碎结构。步骤步骤4中过滤得到的是中过滤得到的是DNA黏稠物，而滤液中含有仍然黏稠物，而滤液中含有仍然溶解在溶解在NaCl溶液中的细胞中的一些成分，如蛋白质等。溶液中的细胞中的一些成分，如蛋白
33、质等。步骤步骤6中过滤后的滤液中含有中过滤后的滤液中含有DNA。(5)实验中两次使用蒸馏水实验中两次使用蒸馏水第一次在第第一次在第1步，目的是使鸡血细胞吸水涨破，加水步，目的是使鸡血细胞吸水涨破，加水后必须充分搅拌，不应少于后必须充分搅拌，不应少于5 min，使血细胞充分吸水，使血细胞充分吸水破裂。破裂。第二次是在第第二次是在第3步，目的是稀释步，目的是稀释NaCl溶液，使溶液，使DNA逐逐渐析出。渐析出。(6)实验中六次搅拌实验中六次搅拌前前5次搅拌均要求朝向一个方向，并且在析出次搅拌均要求朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解和提取各步中，搅拌都要轻缓，玻璃棒不要再溶解和提取各步中，
34、搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。分子断裂。关于关于“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”的实验装置如图：的实验装置如图：(1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血。主要原因是实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血。主要原因是 鸡血细胞液中鸡血细胞液中_含量较高。含量较高。(2)在上图在上图A所示的实验步骤中加蒸馏水所示的实验步骤中加蒸馏水20 mL的目的是的目的是 _。通过图。通过图B所示的步骤取得滤液，再在所示的步骤取得滤液，再在 滤液中加入滤液中加入2 molL1NaCl溶液的目的是溶液的目的是_，图图C所示实验中加蒸馏水的目的是所示实验中加蒸馏水
35、的目的是_。(3)为鉴定实验所得丝状物的主要成分是为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可滴加，可滴加 _溶液，结果丝状物被染成绿色。溶液，结果丝状物被染成绿色。解析解析(1)鸡血细胞中含较多的鸡血细胞中含较多的DNA，而血浆中不含，而血浆中不含DNA，因此，因此 实验材料应用鸡血细胞液而不用鸡全血。实验材料应用鸡血细胞液而不用鸡全血。(2)要明确区别两次加蒸馏水的目的，第一次目的是让鸡血要明确区别两次加蒸馏水的目的，第一次目的是让鸡血细胞吸水涨破，放出细胞吸水涨破，放出DNA，第二次加蒸馏水是为了降低，第二次加蒸馏水是为了降低NaCl溶液的浓度，使溶解于溶液的浓度，使溶解于2 molL1N
36、aCl溶液中的溶液中的DNA析析出。出。(3)本题考查本题考查DNA的鉴定，可以加二苯胺沸水浴变蓝色，也的鉴定，可以加二苯胺沸水浴变蓝色，也可加甲基绿使可加甲基绿使DNA变绿色，本题干无沸水浴这一条件，且变绿色，本题干无沸水浴这一条件，且结果是丝状物变绿色，所以使用的试剂为甲基绿。结果是丝状物变绿色，所以使用的试剂为甲基绿。答案答案(1)DNA(2)使血细胞吸水涨破，放出使血细胞吸水涨破，放出DNA使滤使滤液中的液中的DNA溶于盐溶液使溶于盐溶液使DNA析出析出(3)甲基绿甲基绿 随堂高考随堂高考1.(2008全国卷全国卷)已知某种限制性内切酶在一线性已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子分子
37、 上有上有3个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性DNA分分 子在子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四四 种不同长度的种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性片段。现有多个上述线性DNA分子，若分子，若 在每个在每个DNA分子上至少有分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理个酶切位点被该酶切断，则从理 论上讲，经该酶酶切后，这些线性论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长分子最多能产生长 度不同的度不同的DNA片段种类数是片段种类数是 ()A.3B.4C.9 D.12解析：解析：若该线
38、性若该线性DNA分子在分子在3个酶切位点切断，得到个酶切位点切断，得到4种长种长度不同的度不同的DNA片段；若在片段；若在2个酶切位点切断，得到个酶切位点切断，得到3种长度种长度不同的不同的DNA片段；若在片段；若在1个酶切位点切断，得到个酶切位点切断，得到2种长度不种长度不同的同的DNA片段。因此最多能产生片段。因此最多能产生4329(种种)长度不同长度不同的的DNA片段。片段。答案：答案：C2(2008海南高考海南高考)下图为某种质粒表达载体简图，小箭头下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶所指分别为限制性内切酶EcoR、BamH的酶切位点，的酶切位点，ampR为青霉素抗
39、性基因。为青霉素抗性基因。tetR为四环素抗性基因，为四环素抗性基因，P为启为启动子，动子，T为终止子，为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括分别有包括EcoR、BamH在内的多种酶的酶切位点。在内的多种酶的酶切位点。据图回答：据图回答：(1)将含有目的基因的将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用与质粒表达载体分别用EcoR酶酶切，酶切产物用切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个连接酶进行连接后，其中由两个DNA片片段之间连接形成的产物有段之间连接形成的产物有_、_、_三种。若要从这些连接产物中分离出重三种。若要从这些连接产物中分离
40、出重组质粒，需要对这些连接产物进行组质粒，需要对这些连接产物进行_。(2)用上述用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_；若接种到含青霉素的培养基中，能生；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有长的原核宿主细胞所含有的连接产物有_。(3)目的基因表达时，目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是聚合酶识别和结合的位点是_，其合成
41、的产物是，其合成的产物是_。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。解析：解析：将含有目的基因的将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用与质粒表达载体分别用EcoR酶切所产生的黏性末端相同，用酶切所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成片段随机结合，可形成3种不同的连接物，这些连接物可采种不同的连接物，这些连接物可采用电泳、层析或超速离心的等手段分离纯化，将这用电泳、层析或超速离心的等手
42、段分离纯化，将这3种连接种连接物导入受体菌后，可根据不同连接物所携带抗性基因的差异物导入受体菌后，可根据不同连接物所携带抗性基因的差异选择不同的选择培养基进行筛选。由图示和题目中提供的信选择不同的选择培养基进行筛选。由图示和题目中提供的信息可知，同时应用息可知，同时应用EcoR和和BamH进行酶切可有效防止酶进行酶切可有效防止酶切后产生末端发生任意连接。切后产生末端发生任意连接。答案：答案：(1)目的基因目的基因载体连接物载体载体连接物载体载体连接物目的载体连接物目的基因基因目的基因连接物分离纯化目的基因连接物分离纯化(2)载体载体载体连接物目的基因载体连接物目的基因载体连接物、载体载体连接物
43、、载体载体载体连接物连接物(3)启动子启动子mRNA(4)EcoR和和BamH(只答一种酶不给分只答一种酶不给分)3.(2008江苏高考江苏高考)将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植 物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是 与植物疫苗制备过程相关的图和表。与植物疫苗制备过程相关的图和表。表表1引物对序列表引物对序列表引物引物对对AP1AACTGAAATGTAGCTATCP2TTAAGTCCATTACTCTAG引物引物对对BS1GTCCGACTAGTGGCTGTGS2AGCTGGCGTTTAGC
44、CTCG表表2几种限制酶识别序列及切割位点表几种限制酶识别序列及切割位点表限制限制酶酶AluEcoRPstSma切割切割位点位点AGCTTCGAGAATTCCTTAAGCTGCAGGACGTCCCCGGGGGGCCC请根据以上图表回答下列问题。请根据以上图表回答下列问题。(1)在采用常规在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主聚合酶，其最主要的特点是要的特点是。(2)PCR过程中退火过程中退火(复性复性)温度必须根据引物的碱基数量和温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表种类
45、来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？较高的退火温度？。(3)图图1步骤步骤所用的所用的DNA连接酶对所连接的连接酶对所连接的DNA两端碱基序两端碱基序列是否有专一性要求？列是否有专一性要求？。(4)为将外源基因转入马铃薯，图为将外源基因转入马铃薯，图1步骤步骤转基因所用的细菌转基因所用的细菌B通常为通常为。(5)对符合设计要求的重组质粒对符合设计要求的重组质粒T进行酶切。假设所用的酶均进行酶切。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图可将
46、识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。采用采用EcoR和和Pst酶切，得到酶切，得到种种DNA片段。片段。采用采用EcoR和和Sma酶切得到酶切得到种种DNA片段。片段。解析：解析：(1)PCR技术扩增技术扩增DNA时，首先要在时，首先要在80100温度温度范围内使范围内使DNA解螺旋。高温解决了打开解螺旋。高温解决了打开DNA双链问题，但双链问题，但又导致了又导致了DNA聚合酶失活的新问题。聚合酶失活的新问题。20世纪世纪80年代，科学年代，科学家从水生耐热细菌家从水生耐热细菌Ta
47、q中分离到耐高温的中分离到耐高温的Taq DNA聚合酶，聚合酶，使体外使体外DNA扩增成为现实。扩增成为现实。(2)碱基碱基A与与T之间是依靠两个氢键相连配对，碱基之间是依靠两个氢键相连配对，碱基C与与G之间之间是通过是通过3个氢键相连配对，个氢键相连配对，DNA分子中碱基分子中碱基C与与G的比例决定的比例决定了了DNA分子的耐高温的程度。引物对分子的耐高温的程度。引物对B中中C与与G的比例明显高的比例明显高于引物对于引物对A，因此，引物对，因此，引物对B可采用较高的退火温度。可采用较高的退火温度。(3)DNA连接酶的作用部位是磷酸基团与五碳糖之间的磷酸连接酶的作用部位是磷酸基团与五碳糖之间的
48、磷酸二酯键，自然，对所连接的二酯键，自然，对所连接的DNA两端碱基序列没有专一性两端碱基序列没有专一性要求。要求。(4)将外源基因导入不同受体细胞时，所用的方法是不同的。将外源基因导入不同受体细胞时，所用的方法是不同的。对于动物细胞常用显微注射法，对于植物细胞最常用农杆菌对于动物细胞常用显微注射法，对于植物细胞最常用农杆菌转化法。故本小题所用的细菌转化法。故本小题所用的细菌B通常为农杆菌。通常为农杆菌。(5)由图由图1过程知，用过程知，用EcoR酶和酶和Alu酶切割抗原基因酶切割抗原基因DNA片段会得到片段会得到XY片段，由图片段，由图1过程可知，用过程可知，用EcoR酶和酶和Sma酶切割质粒
49、产生酶切割质粒产生MN片段。这样形成的两个片段。这样形成的两个DNA片段用片段用DNA连接酶形成重组质粒。其中连接酶形成重组质粒。其中X、M连接处是连接处是EcoR酶切割酶切割位点，位点，M、N之间还有一个之间还有一个Pst酶切割位点。如果用酶切割位点。如果用EcoR酶和酶和Pst酶切割重组质粒，将会在两个切割位点切割产生酶切割重组质粒，将会在两个切割位点切割产生2种种DNA片段。但若用片段。但若用EcoR和和Sma I酶切割重组质粒，由于酶切割重组质粒，由于只有一个切割位点只有一个切割位点(由图由图1过程判断过程判断)，故只产生，故只产生1种种DNA片段。片段。答案：答案：(1)耐高温耐高温
50、(2)引物对引物对B(3)否否(4)农杆菌农杆菌(5)214(2009福建高考福建高考)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有质粒上有PstI、SmaI、EcoRI、ApaI等四种限制酶切割位等四种限制酶切割位点。请回答：点。请回答：(1)构建含抗病基因的表达载体构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶时，应选用限制酶_，对对_进行切割。进行切割。(2)培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表