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1、关于原核生物的基因表达与操作第一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月目的基因目的基因 载体载体体外重组体外重组体外重组体外重组重组子（杂合重组子（杂合DNA）转化转化转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNA基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线第二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月第三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月重组基因表达的目的重组基因表达的目的 1.1.蛋白质功能研究蛋白质功能研究 2.2.生物制药和疫苗生产生物制药和疫苗生产 3.3.疾病的基因治疗疾病的基因治疗 4.4.食品、化工用酶制剂食品、化工用酶制剂 5.
2、5.抗虫、抗逆植物改良抗虫、抗逆植物改良 6.6.细胞代谢产物的富集细胞代谢产物的富集第四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月重组基因表达体系重组基因表达体系1.原核体系2.真核体系 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌乳酸菌乳酸菌乳酸菌乳酸菌 沙门氏杆菌沙门氏杆菌沙门氏杆菌沙门氏杆菌 苏云金杆菌苏云金杆菌苏云金杆菌苏云金杆菌 酵母细胞酵母细胞酵母细胞酵母细胞 昆虫细胞昆虫细胞昆虫细胞昆虫细胞 植物细胞、组织植物细胞、组织植物细胞、组织植物细胞、组织 动物细胞、组织动物细胞、组织动物细胞、组织动物细胞、组织第五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月大肠杆菌
3、表达体系大肠杆菌表达体系优越性优越性：n n1.1.1.1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；的分子机理有深刻的了解；的分子机理有深刻的了解；的分子机理有深刻的了解；n n2.2.2.2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；用的寄主菌株和不同类型的载体；用的寄主菌株和不同类型的载体；用的寄主
4、菌株和不同类型的载体；n n3.3.3.3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；实现有效、高水平的表达；实现有效、高水平的表达；实现有效、高水平的表达；n n4.4.4.4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产。用于批量生产。用于批量生产。用于批量生产。大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系第六张，PPT共七十五页，
5、创作于2022年6月大肠杆菌中表达体系的大肠杆菌中表达体系的不足不足：n n1.1.1.1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。大的差别。大的差别。大的差别。n n2.2.2.2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNARNARNARNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因聚合酶不能识别真核的启动子；外源基
6、因聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。酸序列。酸序列。酸序列。n n3.3.3.3.真核基因真核基因真核基因真核基因mRNAmRNAmRNAmRNA的分子结构同细菌的有所差异，的分子结构同细菌的有所差异，的分子结构同细菌的有所差异，的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因影响真核基因影响真核基因影响真核基因mRNAmRNAmRNAmRNA稳定性。稳定性。稳定性。稳定性。第七张，PPT共七十五页，创作于2022年6月n4.4.
7、许多真核基因的蛋白质产物，都要经过许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装），转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；并不存在；n5.5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。第八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月1.1.1.1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的通过表
8、达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。酶系统合成外源蛋白。酶系统合成外源蛋白。酶系统合成外源蛋白。2.2.2.2.外源基因不能带有间隔顺序外源基因不能带有间隔顺序外源基因不能带有间隔顺序外源基因不能带有间隔顺序(内含子内含子内含子内含子)，因而必须用，因而必须用，因而必须用，因而必须用cDNAcDNAcDNAcDNA或全化学合成基因，而不能用基因组或全化学合成基因，而不能用基因组或全化学合成基因，而不能用基因组或全化学合成基因，而不能用基因组DNADNADNADNA。3.3.3.3.必须利用原核细胞的强启动子和必须利用原核细胞的强启动子和必须利用原核细胞的强启动子和必须
9、利用原核细胞的强启动子和SDSDSDSD序列等调控元序列等调控元序列等调控元序列等调控元件控制外源基因的表达。件控制外源基因的表达。件控制外源基因的表达。件控制外源基因的表达。4.4.4.4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架框架框架框架(ORF)(ORF)(ORF)(ORF)。5.5.5.5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防利用宿主菌
10、的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。n重组基因在原核细胞中表达具备条件重组基因在原核细胞中表达具备条件 第九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 启动子启动子启动子启动子 核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点(SD(SD序列序列序列序列)终止子终止子终止子终止子 选择标记基因选择标记基因选择标记基因选择标记基因 复制子复制子复制子复制子 n 原核生物基因表达载体的组成特征原核生物基因表达载体的组成特征 第十张，PPT共七十五页，
11、创作于2022年6月启动子启动子启动子启动子核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点转录终止子转录终止子转录终止子转录终止子大肠杆菌表达载体第十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月n报报告告基基因因（reporter reporter genegene）：特特指指那那些些编编码码产产物物可可以以被被快快速速测测定定的的功功能能核核苷苷酸酸编编码码单单元元（半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因、碱碱性性磷磷酸酸酶酶基基因因、萤萤光光素素酶酶基基因因、半半乳乳糖糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。n追追踪踪某某种种特特定定的的DNADNA结
12、结构构（重重组组质质粒粒）是是否否已已经经导导入入寄寄主主细细胞胞、抑抑或或是是器器官官和和组组织织；也也可可用用来来同同任任何何一一种种目目的的启启动动子子连连接接，因因此此其其表表达达活活性性可可作作为为检测启动子功能的依据。检测启动子功能的依据。第十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月nLac(Lac(乳糖启动子乳糖启动子)nTrp(Trp(色氨酸启动子色氨酸启动子)nTac(Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子乳糖和色氨酸的杂合启动子)nP PL L(噬菌体的左向启动子噬菌体的左向启动子)nT7T7噬菌体启动子噬菌体启动子 常用的可调控启动子常用的可调控启动子通过与通过与通过与通过
13、与阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白的相互作用来控制基因的启动和停止的相互作用来控制基因的启动和停止的相互作用来控制基因的启动和停止的相互作用来控制基因的启动和停止第十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月大肠杆菌的大肠杆菌的LacLac启动子启动子 n n来自大肠杆菌的乳糖操纵子来自大肠杆菌的乳糖操纵子来自大肠杆菌的乳糖操纵子来自大肠杆菌的乳糖操纵子 n n由由由由阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白基基基基因因因因(LacI)(LacI)(LacI)(LacI)、启启启启动动动动基基基基因因因因(P)(P)(P)(P)、操操操操纵纵纵纵基基基基因因因因(O)(O)(O)(O)和和和和编码编
14、码编码编码3 3 3 3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成 n n受活化蛋白和受活化蛋白和受活化蛋白和受活化蛋白和cAMP cAMP cAMP cAMP 的正调控，阻遏蛋白的负调控的正调控，阻遏蛋白的负调控的正调控，阻遏蛋白的负调控的正调控，阻遏蛋白的负调控n n受受受受IPTGIPTGIPTGIPTG（异异异异丙丙丙丙基基基基硫硫硫硫代代代代半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷）、TMGTMGTMGTMG（硫硫硫硫甲甲甲甲基基基基半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷）、ONPGONPGONP
15、GONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导n nLacUV5LacUV5LacUV5LacUV5启动子启动子启动子启动子：LacLacLacLac启动子的衍生物启动子的衍生物启动子的衍生物启动子的衍生物第十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月大肠杆菌的大肠杆菌的trptrp启动子启动子 n n来自大肠杆菌的色氨酸操纵子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子n n由由由由启启启启动动动动子子子子、衰衰衰衰减减减减子子子子、操操操操纵纵纵纵基基基基因因因因及及及及trpE
16、trpEtrpEtrpE的的的的部部部部分分分分结结结结构构构构基基基基因因因因组组组组成成成成n n受受受受阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白和和和和衰衰衰衰减减减减子子子子的的的的调调调调控控控控，阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白前前前前体体体体必必必必须须须须与与与与色色色色氨氨氨氨酸结合才有活性酸结合才有活性酸结合才有活性酸结合才有活性 n n3-3-3-3-吲吲吲吲哚哚哚哚丙丙丙丙烯烯烯烯酸酸酸酸（IAAIAAIAAIAA）可可可可竞竞竞竞争争争争性性性性抑抑抑抑制制制制色色色色氨氨氨氨酸酸酸酸与与与与阻阻阻阻遏遏遏遏蛋白的结合，提高转录活性。蛋白的结合，提高转录活性。蛋白的结合，提高
17、转录活性。蛋白的结合，提高转录活性。第十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月TacTac启动子启动子 n n是一组由是一组由是一组由是一组由LacLacLacLac和和和和trptrptrptrp启动子人工构建的杂合启动子，启动子人工构建的杂合启动子，启动子人工构建的杂合启动子，启动子人工构建的杂合启动子，其启动能力比其启动能力比其启动能力比其启动能力比LacLacLacLac和和和和trptrptrptrp都强；都强；都强；都强；n n受受受受LacLacLacLac阻遏蛋白的负调节，受阻遏蛋白的负调节，受阻遏蛋白的负调节，受阻遏蛋白的负调节，受IPTGIPTGIPTGIPTG（异丙
18、基硫代半（异丙基硫代半（异丙基硫代半（异丙基硫代半乳糖苷）的诱导乳糖苷）的诱导乳糖苷）的诱导乳糖苷）的诱导 。第十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月噬菌体的左向启动子噬菌体的左向启动子P PL Ln n来自来自来自来自噬菌体早期左向转录启动子，活性比噬菌体早期左向转录启动子，活性比噬菌体早期左向转录启动子，活性比噬菌体早期左向转录启动子，活性比TrpTrpTrpTrp启动启动启动启动子高约子高约子高约子高约11111111倍；倍；倍；倍；n n受控于温度敏感的阻遏蛋白受控于温度敏感的阻遏蛋白受控于温度敏感的阻遏蛋白受控于温度敏感的阻遏蛋白cIcIcIcI 。在低温。在低温。在低温。在
19、低温(28-30)(28-30)(28-30)(28-30)时，时，时，时，cIts857cIts857cIts857cIts857阻遏蛋白可阻遏阻遏蛋白可阻遏阻遏蛋白可阻遏阻遏蛋白可阻遏P P P PL L L L启动子转录。在高温启动子转录。在高温启动子转录。在高温启动子转录。在高温(42)(42)(42)(42)时，时，时，时，cIts857cIts857cIts857cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使蛋白失活，阻遏解除，促使蛋白失活，阻遏解除，促使蛋白失活，阻遏解除，促使P P P PL L L L启动子转录。启动子转录。启动子转录。启动子转录。第十七张，PPT共七十五页，创作于2
20、022年6月1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体载体1）强启动子）强启动子:tac（trp-lac）2）操纵基因：乳糖操纵子系统）操纵基因：乳糖操纵子系统 trp的的-35区区 lacUV5的的-10区区 laclac操纵基因操纵基因 常用大肠杆菌表达载体常用大肠杆菌表达载体 3）表达诱导物：）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）第十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月条件：条件：必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。第十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月非融合蛋白：非融合蛋白：非融合蛋白：非融
21、合蛋白：指所表达的外源蛋白的指所表达的外源蛋白的指所表达的外源蛋白的指所表达的外源蛋白的N N N N端或端或端或端或C C C C端不含任何其他端不含任何其他端不含任何其他端不含任何其他氨基酸。氨基酸。氨基酸。氨基酸。所表达的蛋白质以真核蛋白的所表达的蛋白质以真核蛋白的所表达的蛋白质以真核蛋白的所表达的蛋白质以真核蛋白的mRNAmRNAmRNAmRNA的的的的AUGAUGAUGAUG为起始，为起始，为起始，为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。在其氨基端不含细菌多肽序列。在其氨基端不含细菌多肽序列。在其氨基端不含细菌多肽序列。第二十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月非融合蛋白特点：非融
22、合蛋白特点：n 表达时要求高：表达时要求高：SDSD序列与序列与ATGATG的距离要的距离要 合适合适。即使改变。即使改变2-32-3个碱基，表达效率也个碱基，表达效率也 会大受影响。会大受影响。n 优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。n 缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降 解，蛋白产量低；分离纯化费时费力，解，蛋白产量低；分离纯化费时费力，成本较高。成本较高。第二十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月2.分泌型表达载体分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌
23、信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。被宿主菌分泌到细胞周质中。pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,1）强启动子：）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。启动子。2）调节基因：）调节基因：lac I。3）S-D序列和起始密码序列和起始密码ATG。4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。5）插入位点区（多克隆位点）。）插入位点区（多克隆位点）。第二十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 表达出的外源基因产物蛋白
24、是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。起的。如：如：pGEX、pET系列系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。优点：便于融合蛋白的分离和纯化。组成结构：组成结构：1）启动子：）启动子：tac 2）操纵基因：）操纵基因：lacP 3）调节基因：）调节基因：lacI 4）S-D序列序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）第二十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月融合蛋白表达系统的构建的三个原则：融合蛋白表达系统的构建的三个原则：首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且
25、其首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定了融合蛋白的裂解方法。决定了融合蛋白的裂解方法。最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外第二十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月生命科学学院生命科学学院第二十五
26、张，PPT共七十五页，创作于2022年6月用融合载体组合表达融合蛋白质：用融合载体组合表达融合蛋白质：以以Ecoli.lacZ为靶基因的组合最典型，含三个不同为靶基因的组合最典型，含三个不同载体，每个载体都有一个载体，每个载体都有一个lacZ启动子和启动子和SD序列，且在序列，且在lacZ基因下游部位具有一基因下游部位具有一EcoR识别序列识别序列(GAATTC)5上游存在着不同数量的上游存在着不同数量的G-C碱基对。三种情况必有一碱基对。三种情况必有一个保持着正确的读码结构，产生出真实的融合蛋白质。个保持着正确的读码结构，产生出真实的融合蛋白质。第二十六张，PPT共七十五页，创作于2022年
27、6月第二十七张，PPT共七十五页，创作于2022年6月第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达第二十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从GST上切下来上切下来第二十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月pGEX-2XpGEX-2X的插入区的插入区pGEX-1XpGEX-1X的插入区的插入区pGEX-3XpGEX-3X的插入区的插入区第三十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月4.其他融合蛋白系统其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）（组氨酸标签）在外源多肽的在外源多肽的N端或端或
28、C端接上端接上6个组氨酸（个组氨酸（His）。）。His-tag能与能与Ni2+柱结合，但很容易被柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。第三十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。这样的蛋白质有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。第三十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达位于位于细胞质细胞质细胞周质细胞周质细胞外细胞外表达产物
29、表达产物形式形式包涵体蛋白包涵体蛋白融合蛋白融合蛋白整合型外源蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白第三十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是：目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是：表达质粒的构建比较简单；表达质粒的构建比较简单；能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细 胞总蛋白的胞总蛋白的20%20%40%40%。目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中包涵体
30、存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借 助于身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最助于身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最 终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。第三十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月包涵体蛋白包涵体蛋白 本质：本质：细胞内蛋白质的不断聚集细胞内蛋白质的不断聚集 包括：包括：1.1.折叠状态的蛋白质的聚集作用；折叠状态的蛋白质的聚集作用；2.2.非折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠
31、状态的蛋白质的聚集作用；3.3.蛋白质的中间体结构。蛋白质的中间体结构。优点：优点：易于分离纯化易于分离纯化第三十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 在一定程度上保持表达产物的结构稳定在一定程度上保持表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物菌体经超声波裂解后，直接通过
32、高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白包涵体表达形式的优点包涵体表达形式的优点第三十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生 物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物
33、的收 率至关重要。率至关重要。经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30%复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。包涵体表达形式的缺点包涵体表达形式的缺点第三十七张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 分离纯化细菌包涵体蛋白质的分离纯化细菌包涵体蛋
34、白质的基本步骤基本步骤：破碎细胞破碎细胞 (Disruption of cell)分离包涵体分离包涵体 (Seperation of inclusion body)溶解包涵体溶解包涵体 (Dissolve inclusion body)蛋白质产物的构象复原等。蛋白质产物的构象复原等。(Recovery of target protein conformation)第三十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月包涵体的复性前准备洗涤：洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.
35、5左右、1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。第三十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月包涵体的溶解 1.采用高浓度的变性剂变性剂，使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GuaHCl 6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GuaSCN）最强。变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。第四十张，PPT共七十五页，创作
36、于2022年6月2.去垢剂去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDSSDS无法彻底无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用的去除而不允许在制药过程中使用（研究）。3.极端极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。第四十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 4.还原剂：还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM DTT，也有使用5mM浓度。实际，
37、还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂EDTA去去除金属离子。除金属离子。第四十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月(伸展态)U(中间态)I(自然态)N A（包涵体）从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白
38、质的自发复性效率极低。蛋白质折叠的三态模型第四十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月复性目的第四十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。第四十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，杂的问题。蛋
39、白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。析分离得以顺利完成。第四十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月包含体蛋白复性方法包含体蛋白复性方法几个要求：几个要求：活性蛋白的回收率高活性蛋白的回收率高正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品折叠复性后
40、应得到浓度较高的蛋白质产品复性过程耗时少复性过程耗时少第四十七张，PPT共七十五页，创作于2022年6月复性常用方法性常用方法 1.1.稀释复性：稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺点是体直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。积增加较大，后续处理困难。稀释蛋白浓度：稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较低的浓度高则容易形成聚集体（较低的复性收率）。有时需低于复性收率）。有时需低于0.01mg/mL0.01mg/mL。脉冲流加复性：脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中，使折叠分批次加入到缓冲液中，使折叠中间体保持在较低的水平。例：在中间体保持在较低的水平。例：在5-10mg/
41、mL5-10mg/mL终终浓度下，溶菌酶复性收率浓度下，溶菌酶复性收率可达可达80%80%以上以上。第四十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 2.2.透析复性：透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作，无法应用到生产规模。作，无法应用到生产规模。3.3.超滤复性：超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许变选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用，性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用，规模较大，缺点是不适合样
42、品量较少的情况，且有规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上）。于膜上）。第四十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6月4.4.色谱复性：色谱复性：辅助手段，兼具分离。辅助手段，兼具分离。4.1 4.1 凝胶过滤复性：凝胶过滤复性：除了蛋白质在胶粒中传质除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生其他作和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些凝胶过滤中脲
43、等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。蛋白质的复性有利。第五十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月第五十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 4.2 4.2 吸附型层析复性：吸附型层析复性：离子交换、疏水层析、离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋
44、白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。下来，在洗脱过程中完成复性。第五十二张，PPT共七十五页，创作于2022年6月第五十三张，PPT共七十五页，创作于2022年6月Solid-Phase(or Matrix-assisted)Refolding Solid-Phase(or Matrix-assisted)Refolding IB inE.coliIB(solidIB(solid)Solubilized IBSolubilized IB(unfolded)(unfolded)AggregateAggregateRefolded Refolded Bioactive Bioactive monom
45、er monomerRefoldingRefoldingSolution-stateSolution-stateF F Solid SupportSolid Support Functional Functional GroupGroupSolid-state Solid-state refoldingrefolding Remove DenaturantRemove DenaturantF F第五十四张，PPT共七十五页，创作于2022年6月第五十五张，PPT共七十五页，创作于2022年6月第五十六张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 5.5.分子伴侣：分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫
46、键异构酶、主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基因工程菌中包侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。第五十七张，PPT共七十五页，创作于2022年
47、6月复性过程中的添加剂复性过程中的添加剂 低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。可防止不可逆聚集体的出现。盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变在非变性浓度下是有效的促进剂。性浓度下是有效的促进剂。第五十八张，PPT共七十五页，创作于2022年6月 In-Vitro Refolding PathwayS SS SS
48、SS SUnfoldedAggregateIntermediate(molten globular)3D Structure3D Structure(Bioactive)(Bioactive)S SS SS SS SCorrectly Correctly FoldedFolded IntramolecularIntramolecular MisfoldingMisfoldingS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS S IntermolecularIntermolecular MisfoldingMisfolding第五十九张，PPT共七十五页，创作于2022年6
49、月Standard IB Renaturation Process Cell DisruptionCell DisruptionRefoldingRefoldingPost-refolding Post-refolding purification steppurification stepIB IsolationIB IsolationIB WashingIB WashingSolubilizationSolubilizationCentrifugationCentrifugation Remove Remove Cell DebrisCell DebrisDenaturantDenatur
50、antPartial RemovalPartial Removal of Denaturant of DenaturantComplete Removal Complete Removal of Denaturant of DenaturantIBDissolved Refolding第六十张，PPT共七十五页，创作于2022年6月61包涵体分离纯化过程细胞培胞培养养收收获细胞胞细胞破碎胞破碎离心离心5-10 000g沉淀物沉淀物冲洗和离心冲洗和离心分离包涵体分离包涵体亲和和纯化和化和复复性性溶解溶解第六十一张，PPT共七十五页，创作于2022年6月62包涵体-细胞破碎,冲洗和分离每每 100