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1、 凋亡抑制基因凋亡抑制基因(jyn)(jyn)在肺癌放射耐受在肺癌放射耐受机理中的作用及临床应用研究机理中的作用及临床应用研究 戴春华戴春华第一页，共四十页。今天着重讨论下面一些今天着重讨论下面一些(yxi)(yxi)问题问题肿瘤治疗的困惑个体化治疗的要求目前热门的研究假设与设想前期的研究与进展我们的一些研究工作(gngzu)(gngzu)研究目标和预期研究成果第二页，共四十页。一、一、肿瘤治疗肿瘤治疗(zhlio)(zhlio)的困惑的困惑 第三页，共四十页。肺癌是全球发病率和死亡率增加最快的肿瘤，在中国肺癌是全球发病率和死亡率增加最快的肿瘤，在中国肺癌发病率和病死率，居恶性肿瘤的首位，并仍
2、在快肺癌发病率和病死率，居恶性肿瘤的首位，并仍在快速直线攀升速直线攀升 。但在肺癌发病率不断增长的同时，由于缺乏但在肺癌发病率不断增长的同时，由于缺乏(quf)(quf)有效的早期诊断方法和治疗措施，有效的早期诊断方法和治疗措施，因此预后不因此预后不良，中位生存期约为良，中位生存期约为6 6个月，个月，2 2年生存率仅为年生存率仅为1010，肺癌总的治愈率仍低于肺癌总的治愈率仍低于15%15%。第四页，共四十页。二、个体化治疗二、个体化治疗(zhlio)(zhlio)的要求的要求第五页，共四十页。无论手术，还是放化疗等非手术治疗，其总的五无论手术，还是放化疗等非手术治疗，其总的五年生存率大约在
3、年生存率大约在10-20%左右左右,并且并且这这个个(zh ge)(zh ge)水平水平已达到了一个平台。已达到了一个平台。在临床确诊时，大多系中晚期在临床确诊时，大多系中晚期患者，患者，60-70%需要放化疗，但是由于缺乏个体化的需要放化疗，但是由于缺乏个体化的治疗方案，总的疗效较差。治疗方案，总的疗效较差。放射治疗仍是中晚期非放射治疗仍是中晚期非小细胞肺癌的主要治疗手段之一，但是有些患者小细胞肺癌的主要治疗手段之一，但是有些患者疗效较好，有些患者却较差。因此通过基因、蛋疗效较好，有些患者却较差。因此通过基因、蛋白等分子生物学指标的检测筛选最能够从放化疗白等分子生物学指标的检测筛选最能够从放
4、化疗中获益的个体或人群，对于实现非小细胞肺癌个中获益的个体或人群，对于实现非小细胞肺癌个体化治疗、提高个体疗效至关重要。体化治疗、提高个体疗效至关重要。第六页，共四十页。三、目前三、目前(mqin)(mqin)放疗界最热门的研放疗界最热门的研究究如何提高肿瘤(zh(zh ngli)ngli)细胞对放疗的敏感性同时减少放射耐受（1）促凋亡基因（2）凋亡抑制基因第七页，共四十页。研究显示凋亡反应的提高研究显示凋亡反应的提高(tgo)提示细胞有更大的放提示细胞有更大的放射敏感性，增加凋亡反应的同时伴随着细胞敏感性射敏感性，增加凋亡反应的同时伴随着细胞敏感性的增加现在有学者将诱导凋亡水平作为肿瘤放射敏
5、的增加现在有学者将诱导凋亡水平作为肿瘤放射敏感性衡量指标。感性衡量指标。Lang FF,Yung WK,Raju U,et al.Enhancement radiosensitivity of wild-type p53 humanglioma cells by adenovirus-mediated delivery of the p53 gene.J Neurosurg,1998,89(1):125-132.Kurdoglu B,Cheong N,Guan J,Corn BW,et al.Apoptosis as a predictor of Paclitaxel-induced radi
6、osen sitization in human tumor cell lines.Clin Cancer Res,1999,5(9):2580-2587.第八页，共四十页。目前促凋亡基因的研究很多。但是对凋凋亡抑制基因在肿瘤放射耐受机理中的作亡抑制基因在肿瘤放射耐受机理中的作用研究还非常少，尤其是目前最新发现用研究还非常少，尤其是目前最新发现的的survivin，livin就更加不知道就更加不知道(zh do)(zh do)他们在他们在放射耐受机理中的角色放射耐受机理中的角色第九页，共四十页。四、假设四、假设(ji(ji sh)sh)与设想：与设想：提高肿瘤细胞对放疗的敏感性同时减少放射(f
7、ngsh)(fngsh)耐受可能的方法与途径第十页，共四十页。（1）首先能够阐明凋亡抑制基因）首先能够阐明凋亡抑制基因(jyn)(jyn)在肿在肿瘤细胞固有的和放射诱导的放射耐受机瘤细胞固有的和放射诱导的放射耐受机制的作用制的作用（2）其次针对凋亡抑制基因这个靶点，）其次针对凋亡抑制基因这个靶点，干扰其活性干扰其活性第十一页，共四十页。致力于探索诱发细胞凋亡的方法，以期提高细胞对放射线的敏感性可能成为一种极具广泛治疗前景的新方法。研究发现许多人体基因均参与诱导肿瘤细胞凋亡的调控。其中诱导凋亡的基因有wtp53,c-myc,ElA,Apo-1/Fas,ced-3,ced-4等，而抑制凋亡的有bc
8、l-2,mtp53,H-ras,ced-9和ElB等。其中尤以bcl-2及p53最引人注目，而bcl-2已被证明与细胞放射(fngsh)敏感性密切相关:其表达下调将导致细胞对射线的敏感性增加。第十二页，共四十页。调控细胞凋亡信号通路(tngl)(tngl),作为肿瘤放疗的增敏根据细胞凋亡可调控的特点(tdi(tdi n)n),利用生物利用生物治疗办法调控细胞凋亡信号通路治疗办法调控细胞凋亡信号通路,可以作可以作为肿瘤放疗的增敏剂为肿瘤放疗的增敏剂,降低肿瘤细胞的放降低肿瘤细胞的放射诱导凋亡的阈值射诱导凋亡的阈值,克服肿瘤细胞对放疗克服肿瘤细胞对放疗诱导细胞凋亡的抗性并增强肿瘤放疗效诱导细胞凋亡
9、的抗性并增强肿瘤放疗效果果已成为科研工作者的一个努力的方向。第十三页，共四十页。五、前期五、前期(qinq)(qinq)的工作与进展的工作与进展第十四页，共四十页。越来越多的研究表明，细胞凋亡与细胞增殖一样，同肿瘤的发生、越来越多的研究表明，细胞凋亡与细胞增殖一样，同肿瘤的发生、发展以及临床治疗有密切的关系。发展以及临床治疗有密切的关系。放射治疗作为肿瘤治疗的重要手段之一,其作用方式主要是通过损伤细胞的DNA,影响细胞的增殖状态,改变细胞周期的运行,最终引起肿瘤细胞的增殖性死亡(swng)或凋亡。凋亡抑制基因凋亡抑制基因可能可能正是在这些方面发挥作用从而导致肿瘤细胞的正是在这些方面发挥作用从而
10、导致肿瘤细胞的放疗抵抗。放疗抵抗。第十五页，共四十页。survivin livinsurvivin livin是是凋亡抑制蛋白凋亡抑制蛋白(dnbi)家族最近发现家族最近发现的新成员，他们在肺癌组织中的表达以及与肺的新成员，他们在肺癌组织中的表达以及与肺癌细胞放射敏感性的关系报道甚少，癌细胞放射敏感性的关系报道甚少，他们在他们在细胞固有的和放射诱导的放射耐受机制的作用没有研究,尤其是尤其是livinlivin还没有这方面的报道。还没有这方面的报道。第十六页，共四十页。第十七页，共四十页。第十八页，共四十页。第十九页，共四十页。v Ling Ling X X等等通通过过检检测测2424例例NSC
11、LCNSCLC中中survivinsurvivin的的两两个个间间接接(jin(jin ji)ji)变变构构体体survivin-2B survivin-2B 和和survivin-Ex3survivin-Ex3在在的的表表达达，发发现现survivin-survivin-2B2B高高水水平平的的表表达达与与患患者者无无复复发发和和存存活活有有关关，相相反反survivin-Ex3survivin-Ex3高高水水平平的的表表达达与与患患者者复复发发和和死死亡亡有有关关。与与此此一一致致，肺肺癌癌细细胞胞株株A549A549中中survivin-2Bsurvivin-2B能能抑抑制制细细胞胞生生
12、长长，诱诱导导细细胞胞凋凋亡亡，survivin-survivin-Ex3Ex3则则保保护护线线粒粒体体电电位位，促促进进细细胞胞生生长长。从从而而认认为为survivin-2B survivin-2B 和和survivin-Ex3survivin-Ex3在在NSCLCNSCLC中中有有着着相相反反的的作作用用，为为肺肺癌癌的的治治疗疗提提供了新的方向。供了新的方向。Differential expression of survivin-2B and survivin-DeltaEx3 is inversely associated with disease relapse and patie
13、nt survival in non-small-cell lung cancer(NSCLC).Lung Cancer.2005 Sep;49(3):353-61 第二十页，共四十页。Survivin与肿瘤放疗抵抗的关系与肿瘤放疗抵抗的关系Survivin参与细胞固有参与细胞固有(gyu)的和放射诱导的放射耐受的和放射诱导的放射耐受机制，抑制机制，抑制Survivin的的mRNA表达可能会提高肿瘤对表达可能会提高肿瘤对辐射的敏感性辐射的敏感性第二十一页，共四十页。Rodel等对三种固有放射敏感性不同的肠癌细胞株等对三种固有放射敏感性不同的肠癌细胞株（低度敏感的（低度敏感的sw480,中度敏感
14、的中度敏感的HCT-15,高度敏感的高度敏感的sw48)用用2和和8Gy剂量照射后，集落形成结果显示，剂量照射后，集落形成结果显示，sw48细胞株的自发和辐射诱导的凋亡水平均高于细胞株的自发和辐射诱导的凋亡水平均高于sw480细胞株，细胞株，Westernblot和和RT-PCR结果显示，结果显示，Survivin在在sw480细胞株中的自发和辐射诱导表达平细胞株中的自发和辐射诱导表达平均高于均高于sw48细胞株，细胞株，HCT-15居中。居中。Survivin表达水表达水平与自发和辐射诱导的凋亡水平成反比，平与自发和辐射诱导的凋亡水平成反比，说明说明Survivin自发凋亡水平可以作为体内直
15、肠癌对放射治疗自发凋亡水平可以作为体内直肠癌对放射治疗的反应指标，的反应指标，Survivin的的mNA和蛋白水平的测定和蛋白水平的测定(cdng)可可以预测直肠癌对放化疗的敏感性以预测直肠癌对放化疗的敏感性第二十二页，共四十页。A sanuma 等对5 个不同放射敏感性的胰腺癌细胞系进行研究后发现,对X 线辐射抵抗最强的PANC-1 细胞株中survivin 的mRNA 水平最高,说明检测照射(zhosh)前的survivin mRNA水平可以预测其放射敏感性;对PANC-1 和辐射最敏感的M IA PaCa-2 给予亚致死剂量照射后,survivin mRNA 的表达水平都有显著的升高,伴
16、随caspase-3 的活性显著下降,与致死剂量照射后存活细胞中的表达相一致。这一结果说明,survivin 参与了细胞固有的和放射诱导的放射耐受机制,抑制survivin 的mRNA 表达可能会提高胰腺癌对辐射的敏感性。A Sanuma K,Moriar,Yajima T,et al.Survivin as a radioresistance factor in pancreatic cancer J.Cancer Res,2000,91(11):1204-1209.第二十三页，共四十页。Livin是最近发现的一个凋亡抑制基因，是IAP家族新成员。Livin基因位于人染色体20q13，全长4
17、.6kb，包含(bohn)7个外显子，基因转录产物mRNA长1.4 kb。第二十四页，共四十页。Livin（ML-IAP/KIAP）主要在一些肿瘤组织细胞中高表达，是抑制肿瘤细胞凋亡的重要因素之一，但是其抗肿瘤细胞凋亡的作用还不明确，可能通过以下(yxi)一些抗细胞凋亡作用的途径。第二十五页，共四十页。1.抗死亡受体介导的细胞凋亡作用(zuyng)：2.抗线粒体介导的细胞凋亡作用3.抗化疗药物介导的细胞凋亡作用第二十六页，共四十页。livin 是怎样参与了细胞是怎样参与了细胞(xbo)(xbo)固有的和固有的和放射诱导的放射耐受机制放射诱导的放射耐受机制,目前还不目前还不明确，没有这方面的报道
18、明确，没有这方面的报道第二十七页，共四十页。UchidaUchida等等3030构建了一种由构建了一种由U6U6启动子驱动的启动子驱动的survivin survivin siRNAsiRNA腺病毒载体，将其分别转染腺病毒载体，将其分别转染U251U251细胞、人宫颈细胞、人宫颈癌癌HeLaHeLa细胞和人乳腺癌细胞和人乳腺癌MCF-7MCF-7细胞后，同样观察到细胞后，同样观察到survivinsurvivin表达受到明显抑制，肿瘤细胞生长减缓，凋亡表达受到明显抑制，肿瘤细胞生长减缓，凋亡细胞增加。上述研究结果提示细胞增加。上述研究结果提示survivinsurvivin可作为人类多可作为人
19、类多种恶性肿瘤基因治疗的一个种恶性肿瘤基因治疗的一个(y(y )潜在靶点，潜在靶点，研究表研究表明明,利用利用RNA RNA 干扰技术干扰技术,设计针对设计针对LivinLivin的特异性的特异性siRNA siRNA 可以阻断可以阻断Livin Livin 基因表达基因表达,并且可以增强肿瘤并且可以增强肿瘤细胞对凋亡诱导剂的敏感性【细胞对凋亡诱导剂的敏感性【31,3231,32】。】。RNAiRNAi则有则有可能成为一种极具潜力的基因治疗工具。可能成为一种极具潜力的基因治疗工具。第二十八页，共四十页。中药对细胞凋亡的影响中药对细胞凋亡的影响(yngxing)(yngxing)多项研究表明从中
20、药中提取的一些有效成分对肿瘤生长有直接抑制作用，能阻止其代谢，降低其分裂增殖能力，下调凋亡抑制基因表达、诱导肿瘤细胞凋亡，改变细胞周期分布。第二十九页，共四十页。中药通过细胞凋亡影响细胞放射敏感性苦参碱和榄香烯作为治疗(zhlio)肿瘤的纯中药已广泛应用于临床，但是这些临床报道并未探究他们作为一种放疗增敏剂的增敏机制，本实验旨在研究苦参，榄香烯对人肺癌细胞放射敏感性的影响:苦参，榄香烯是否增加人肺癌细胞的放射敏感性及不同浓度一时间作用后的增敏效果如何。并进一步探讨他们的放射增敏的机制。为放射增敏临床研究提供新思路和借鉴，为中药放射增敏研究提供方法第三十页，共四十页。我们自己的一些我们自己的一些
21、(yxi)(yxi)工作工作第三十一页，共四十页。我们已经熟练掌握了细胞培养，RT-PCR,荧光(ynggung)(ynggung)定量PCR,Westen Blot,，RNAi等多种分子生物学技术，以细胞培养为研究工具已经发表了多篇论文。第三十二页，共四十页。本研究(ynji)(ynji)中的三种细胞培养国内外均有文献报道，技术成熟，本课题组已经熟练掌握。完成了江苏大学临床医学科技发展基金肺癌组织中凋亡抑制基因Livin与多药耐药的关系及临床应用研究(ynji)(ynji)，部分研究成果已经发表在Jpn J Clin Oncol.2010（SCI收入.）。第三十三页，共四十页。60例非小细胞
22、肺癌非小细胞肺癌组织(z(z zh)zh)survivin的表达PCR图谱 第三十四页，共四十页。60例非小细胞肺癌非小细胞肺癌组织(z(z zh)zh)中 livin的表达PCR图谱(图 1)第三十五页，共四十页。1 1，SurvivinSurvivin，livinlivin蛋白在凋亡信号通蛋白在凋亡信号通路上的作用机理。路上的作用机理。Survivin Survivin，livinlivin表达表达水平是否与自发和辐射诱导的凋亡水平的水平是否与自发和辐射诱导的凋亡水平的关系密切，他们过表达，是否对自发和辐关系密切，他们过表达，是否对自发和辐射诱导的凋亡可能有明显的抑制作用，是射诱导的凋亡可
23、能有明显的抑制作用，是否在肺癌细胞否在肺癌细胞(xbo)(xbo)固有的和放射诱导的放固有的和放射诱导的放射耐受中扮演重要角色。射耐受中扮演重要角色。六、六、研究研究(ynji)(ynji)(ynji)(ynji)目标和预期研究目标和预期研究(ynji)(ynji)(ynji)(ynji)成果成果 第三十六页，共四十页。2 2，Survivin Survivin，livinlivin基因基因RNARNA干扰后，干扰后，自发和辐射诱导的凋亡水平是否明显增自发和辐射诱导的凋亡水平是否明显增加，肺癌细胞固有的和放射诱导的放射加，肺癌细胞固有的和放射诱导的放射抵抗是否减弱。抵抗是否减弱。Survivi
24、n Survivin，livinlivin可否可否作为肺癌等多种恶性肿瘤基因治疗的一作为肺癌等多种恶性肿瘤基因治疗的一个潜在靶点，而个潜在靶点，而RNAiRNAi则是否可能成为则是否可能成为(chngwi)(chngwi)一种极具潜力的基因治疗工具。一种极具潜力的基因治疗工具。第三十七页，共四十页。3，药物对辐射干预：中药苦参碱和榄香烯能否通过抑制凋亡抑制因子的表达，从而增加自发和辐射诱导的凋亡水平，减少放射诱导的放射耐受，增加肿瘤(zhngli)放射敏感性，获得治疗增益。为肺癌临床的个体化治疗提供理论基础。第三十八页，共四十页。请各位专家请各位专家(zhunji)(zhunji)批评指正批评指正！谢谢！谢谢！第三十九页，共四十页。内容(nirng)总结凋亡抑制基因(jyn)在肺癌放射耐受。提高肿瘤细胞对放疗的敏感性同时减少放射耐受可能的方法与途径。致力于探索诱发细胞凋亡的方法，以期提高细胞对放射线的敏感性可能成为一种极具广泛治疗前景的新方法。并进一步探讨他们的放射增敏的机制第四十页，共四十页。