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1、DNA分子标记技术类型以以SouthernSouthern杂交为基础的分子标记技术：杂交为基础的分子标记技术：限制性内切酶片段长度多态性标记（限制性内切酶片段长度多态性标记（RFLPRFLP）以以PCRPCR为基础的分子标记技术：为基础的分子标记技术：随机引物随机引物PCRPCR标记标记和和特异引物特异引物PCRPCR标记标记随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA（RAPDRAPD）扩增的限制性内切酶片段长度多态性（扩增的限制性内切酶片段长度多态性（AFLPAFLP）相关序列扩增多态性（相关序列扩增多态性（SRAPSRAP）简单重复序列（简单重复序列（SSRSSR）或简单序列长度多态性（）或
2、简单序列长度多态性（SSLPSSLP）以以mRNAmRNA为基础的分子标记技术：为基础的分子标记技术：差异显示（差异显示（DDDD）逆转录逆转录PCRPCR（RTRTPCRPCR）以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术：以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术：单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPSNP）第1页/共30页SSR简介在在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序序列，列，根据重复序列在基因组中的分布形式可分为根据重复序列在基因组中的分布形式可分为：串联重复序列串联重复序列（Tandemly repeated sequ
3、encesTandemly repeated sequences）分散重复序列（分散重复序列（Interspersed repeated sequencesInterspersed repeated sequences）依据重复基序的依据重复基序的长度长度、拷贝数拷贝数和和位置位置等又将串联等又将串联 重复序列分为：重复序列分为：卫星卫星DNADNA：基序（：基序（motifmotif）长）长1010300bp300bp，甚至长，甚至长1,0001,000100,000bp100,000bp；小卫星小卫星DNADNA：基序长：基序长101060bp60bp；微卫星微卫星DNADNA：基序长：基
4、序长1 16bp6bp，其，其功能功能：重组热点、对基因的调节和重组热点、对基因的调节和表达以及性别决定等。表达以及性别决定等。第2页/共30页SSR简介微卫星微卫星DNADNA即即简单重复序列简单重复序列（simple sequence repeatsimple sequence repeat，SSRSSR），），或者或者微卫星序列微卫星序列（microsatellitemicrosatellite，MSMS），），又称又称短串联重复短串联重复（short tandem repeatsshort tandem repeats，STRSTR），），是一类由几个核苷酸（多为是一类由几个核苷酸（多
5、为2 24 4个）为个）为基本基本单位单位多次串联重多次串联重复而复而形形成的成的DNADNA片段片段，其长度一般较短，其长度一般较短，多多在在200bp200bp以内。以内。微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，均匀分布于整个植微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，均匀分布于整个植物物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大，基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大，但但（ATAT）n n最多。最多。第3页/共30页SSR标记的基本原理尽管微卫星尽管微卫星DNADNA分布于整个基因组中的不同位置，但分布于整个基因组中的不同位置，但某一特定的微卫星的两端某一特定的微卫星的两端侧翼序
6、列侧翼序列通常都是通常都是保守性较保守性较强的强的单一单一序列序列，将重复序列及其两侧的将重复序列及其两侧的DNADNA片段进片段进行行克隆克隆和和测序测序，然后根据两端的侧翼序列，然后根据两端的侧翼序列设计一设计一对特异引物对特异引物，通过，通过PCRPCR技术将技术将目的目的微卫星微卫星DNADNA片段片段扩增出来扩增出来。第4页/共30页SSR标记的基本原理由于单个微卫星位点由于单个微卫星位点的的重复单元在数量上的不同重复单元在数量上的不同，导致，导致扩增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这扩增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种种多态性称为多态性称为简单序列长度多态性简单
7、序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)，每一扩增位点就代表，每一扩增位点就代表了该位点的一对等位基因。了该位点的一对等位基因。SSR标记的多态性主要依赖于基本单位重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的，因此，SSR具有大量的等位差异，多态性十分丰富。第5页/共30页第6页/共30页第7页/共30页PCR技术的基本原理聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，PCRPCR）是利用单链寡核苷酸引物对特异）是利用单链寡核苷酸引物对特异DN
8、ADNA片段进行体外片段进行体外快速扩增的一种方法。快速扩增的一种方法。特点一：特点一：使使特定的特定的DNADNA片段得到片段得到了迅速大量的扩增，了迅速大量的扩增，理论上的最高值达理论上的最高值达2 2n-2n-2；特点二：能够特点二：能够指导指导特定特定DNADNA片段片段的合成。的合成。如何实现？如何实现？第8页/共30页第9页/共30页第10页/共30页PCR反应体系一对特异引物：1.引物长度：典型的引物长度为18-24bp，引物需要足够长，保证序列独特性。但是长度大于24bp的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低
9、了产量；2.引物浓度：一般0.1-0.5 mol/L，过高的引物浓度会加剧错配发生，特异性下降；3.合理的G/C含量：一般为4060。第11页/共30页PCR反应体系Mg2溶液：其浓度直接影响引物退火的特异性、产物特异性以及酶的催化能力和准确性等，适当降低Mg2浓度可增加特异性。模板DNA：一般1ng/1L，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加；dNTP：常用浓度为50-200 mol/L，种dNTP浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。Taq酶：DNA聚合酶，热稳定，最适温度72，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。10buffer缓冲液（不含Mg2）
10、：维持PCRpH的稳定。第12页/共30页PCR循环条件高温变性：双链DNA模板加热变性成单链；低温退火：在低温下引物与单链DNA互补配对；退火温度针对不同的引物差别较大，退火温度过低，极易形成非特异扩增，而退火温度过高，又难以扩增出条带，对于长度为20bp，GC含量为50的核苷酸的典型引物，55是比较适宜的退火温度。适温延伸：在适宜温度下TaqDNA酶催化引物沿着模板DNA延伸。第13页/共30页PCR条件优化优化引物设计：这是最关键的，可以借助计算机来辅助设计引物。热启动技术：在PCR反应的第一个循环中待温度升高且超过模板Tm值（80）后，再加入关键试剂如TaqDNA聚合酶等。这样操作可以
11、减少非特异性扩增。创造一个有利于增加特异性扩增的条件：如降低Mg2，dNTP浓度，优化pH及减少Taq酶的用量，减少循环中各部分的时间或循环数，提高退火温度等。第14页/共30页电泳原理在生理条件下，核酸分子之糖磷酸骨架中的磷酸基团，在生理条件下，核酸分子之糖磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。当核酸分子被放置在电场中时，他是呈离子化状态的。当核酸分子被放置在电场中时，他们就会向们就会向正电极正电极的方向迁移。的方向迁移。在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNADNA分子的这种迁移速度，亦即电分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子泳的迁移率，取决于
12、核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的量较小的DNADNA分子，比分子量较大的分子，比分子量较大的DNADNA分子，具有较紧分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率较快。密的构型，所以其电泳迁移率较快。第15页/共30页电泳介质琼脂糖琼脂糖凝胶凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 优点：优点：分辨率极高分辨率极高，可分开长度仅相差，可分开长度仅相差0.10.1的的DNADNA分子，分子，即即 1000bp1000bp中相差中相差1bp1bp；从聚丙烯酰胺凝胶中从聚丙烯酰胺凝胶中回收的回收的DNADNA纯度很高纯度很高，可用于要，可用于要求最高的实验。求最高的实验。第16页/共30页聚丙烯酰胺凝胶聚
13、丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺丙烯酰胺单体，在催化剂单体，在催化剂TEMEDTEMED(N,N,N,N(N,N,N,N一四甲基乙二胺一四甲基乙二胺)和和过硫酸铵过硫酸铵的作用下，的作用下，聚合形成线状长链，在交联剂如聚合形成线状长链，在交联剂如N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺参参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接而形成三维带状网络结构的凝胶而形成三维带状网络结构的凝胶。这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度剂的浓度。第17页/共30页第18页/
14、共30页聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶 用于用于单链单链DNADNA片断的分离与纯化。这些凝胶在片断的分离与纯化。这些凝胶在尿素尿素或或甲酰胺甲酰胺等等抑抑制核酸碱基配对制核酸碱基配对的试剂的存在下发生聚合。变性的的试剂的存在下发生聚合。变性的DNADNA在这些凝胶在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于用于双链双链DNADNA片段的片段的分离和纯化。双链分离和纯化。双链DNADNA在非变性聚丙烯酰胺在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁
15、凝胶中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁移率也受其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条移率也受其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条DNADNA的迁移率可相差的迁移率可相差1010。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高制备高纯度的纯度的DNADNA片段片段和和检测蛋白质检测蛋白质DNADNA复合物复合物。第19页/共30页用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时，通常PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离效果优于非变性胶。因为杂合个体在PCR后期的循环中会产生异源双链分子，导致在杂合的情况下胶中产生了3条带甚至是4条带，而不是正常
16、的2条带。这种情况出现会干扰等位基因的统计。第20页/共30页染色方法与原理溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）染色）染色法：法：但是聚丙烯酰胺对荧光燃料溴化乙但是聚丙烯酰胺对荧光燃料溴化乙锭的荧光有锭的荧光有猝灭猝灭作用，作用，EBEB染色法很难检测到少于染色法很难检测到少于10ng10ng的的DNADNA条带条带。银染法银染法（硝酸银）（硝酸银）：是一种检测微量是一种检测微量DNADNA的理想方法。的理想方法。优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永久保存可永久保存原理：原理：银染液中的银染液中的银离子银离子(Ag+)(Ag+)
17、可与可与DNADNA形成稳定的复合物，然形成稳定的复合物，然后用还原剂如后用还原剂如甲醛甲醛在在碱性条件碱性条件下使下使Ag+Ag+还原成银颗粒，可把还原成银颗粒，可把DNADNA电泳带染色成黑褐色电泳带染色成黑褐色第21页/共30页载样缓冲液（loading buffer）指示剂（溴酚蓝或二甲苯氰）一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400等组成载样缓冲液，加入到扩增好的PCR产物当中。作用：1.增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。2.形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。3.使样品呈色，使加样操作更方便。第22页/共30页实验方法与步骤1.1.实验材料实验材料马贵荔马贵
18、荔（母本）（母本）焦核三月红焦核三月红（父本）（父本）F1F1杂种群体中部杂种群体中部分个体的基因组分个体的基因组DNADNA溶液。每人做溶液。每人做4 4个模板个模板。一对特异引物：一对特异引物：B-F09 FB-F09 F：5TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 35TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3B-F09 RB-F09 R：5CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 35CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 3第23页/共30页2.2.配制配制SSRSSR扩增的反应液：扩增的反应液：各组份的用量及终浓度如下表，各组份的用量及终浓度如下表，做多个反应做多个反应时时
19、，可将所用的的相同组，可将所用的的相同组份一次取样、混匀后再分装至各个反应中。份一次取样、混匀后再分装至各个反应中。组分组分1 1个反应体积个反应体积终浓度终浓度4 4个反应体积个反应体积ddHddH2 2O O10.210.2L L40.840.8L L1010bufferbuffer缓冲液缓冲液（含（含15mM Mg15mM Mg）2.02.0L L1 18 8L L2.5mM dNTP2.5mM dNTP1.61.6L L0.2mM0.2mM6.46.4L L5 5M M 引物引物F F1.01.0L L0.25M0.25M4 4L L5 5M M 引物引物R R1.01.0L L0.2
20、5M0.25M4 4L L模板模板DNADNA（5ng/5ng/L L）4 4L L1ng/L1ng/LTaqTaq酶（酶（5U/5U/L L）0.20.2L L1U1U0.80.8L L总体积总体积2020L L8080L L第24页/共30页3.SSR-PCR3.SSR-PCR配制好反应液后，放入配制好反应液后，放入PCRPCR仪中进行扩增反应，扩增程序仪中进行扩增反应，扩增程序为：为：9494 3min3min（预变性）；（预变性）；9494 50s50s5555 50s50s727250s50s（3535个循环）；个循环）；7272 10min 10min（延伸反应）（延伸反应）第25
21、页/共30页4.4.制备制备5 5的变性聚丙烯酰胺凝胶：的变性聚丙烯酰胺凝胶：将将长、短长、短玻璃板固定在制胶板上，用玻璃板固定在制胶板上，用1.01.0的琼脂糖封口的琼脂糖封口，将配将配好的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插好的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳子，静置入梳子，静置1h1h，让其聚合凝固。，让其聚合凝固。5 5变性胶变性胶100ml100ml尿素尿素 （UreaUrea）42g42g5 5TBE bufferTBE buffer20ml20ml4040丙稀酰胺丙稀酰胺12.5ml12.5ml1010过硫酸铵过硫酸铵400400l lTE
22、MEDTEMED87.587.5l l4040丙稀酰胺溶液（丙稀酰胺溶液（1919：1 1）100ml100ml丙稀酰胺（丙稀酰胺（AcrylamideAcrylamide）38g38g甲义甲义-丙稀酰胺（丙稀酰胺（Bis-AcrylamideBis-Acrylamide）2g2g第26页/共30页5.5.电泳样品的准备：电泳样品的准备：在在PCRPCR产物中加入产物中加入8 8L L的的loadingloading bufferbuffer混合，混合，得到混合物，得到混合物，9595加热加热3min3min，迅速置于冰上冷却，迅速置于冰上冷却，然后，然后点样。点样。6.6.电泳：电泳：每个点
23、样孔中，点加适量的混合物（每个点样孔中，点加适量的混合物（4 4L L），每排梳孔中），每排梳孔中最左边的梳孔用于点加最左边的梳孔用于点加DNA MarkerDNA Marker（分子量标记物），以便计算（分子量标记物），以便计算分子量，以分子量，以300V300V电压进行恒压电泳，电压进行恒压电泳，电泳液为电泳液为0.5TBE0.5TBE，待溴酚待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳。LoadingbufferLoadingbuffer组分组分用量用量9898FormamideFormamide（甲酰胺）（甲酰胺）49ml49ml（100100）10MmEDTA1
24、0MmEDTA（pH8.0pH8.0）1ml1ml（0.5M0.5M，pH8.0pH8.0）0.250.25Bromophenol BlueBromophenol Blue（溴酚蓝）（溴酚蓝）0.125g0.125g第27页/共30页7.7.染色染色步骤步骤试剂试剂漂洗漂洗30s30sddHddH2 2O O染色染色8min8min0.10.1硝酸银硝酸银400ml400ml漂洗漂洗30s30sddHddH2 2O O显色显色4min4min8g NaOH8g NaOH，2ml 372ml 37甲醛，甲醛，0.1g0.1g四硼酸四硼酸钠定容至钠定容至500ml500ml漂洗漂洗ddHddH2 2O O第28页/共30页8.8.观察观察记录记录父母本及父母本及F1F1代的带型，供进一步的分析用。代的带型，供进一步的分析用。第29页/共30页谢谢您的观看！第30页/共30页