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1、微生物的生长与环境条件一、微生物生长测定二、微生物的生长规律三、微生物的培养四、微生物生长的环境条件五、消毒与灭菌第1页/共52页第一节、微生物生长测定一、测定单细胞微生物数量（一）总菌数测定法1.计数板测定法2.比浊法(二)活菌数测定法1.平板菌落计数法2.液体稀释测定法3.膜过滤计数法第2页/共52页二、测定微生物生长量和生理指标1.干重法2.蛋白质含量测定法3.其他生理指标测定法第3页/共52页(一)微生物数量的测定 1、显微镜直接计数法 使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。优点：操作简便，计数直观。一、微生物生长量的测定第4页/共52页(一)微生物数量的测定 2、稀释平板计数
2、法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。优点：传统计数方法。对设备要求不高。一、微生物生长量的测定10-310-510-410-6第5页/共52页(一)微生物数量的测定 、比浊计数法根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。优点：简便，直接。一、微生物生长量的测定第6页/共52页(二)微生物重量的测定 1、称重法 用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。优 点：简单可靠。一、微生物生长量的测定第二节 微生物纯培养群体生长规律在活性污泥法中采用的指标：（1）混合液悬浮固体(MLSS)（粗放测定）污泥干燥-称重(W1)（2）挥发性悬浮固体(MLVSS)（相对准确）上述已称重污泥-马福炉
3、(500度2小时)-冷却-称重(W2)第7页/共52页(二)微生物重量的测定 2、蛋白质含量测定法 根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。一、微生物生长量的测定原理：（1）微生物蛋白质含量稳定 （2）氮是蛋白质的稳定成分 (蛋白质量=6.25总含N量)优点：测定准确。第8页/共52页微生物的生长规律一、无分支单细胞微生物的群体生长规律（一）生长曲线1.延滞期2.对数期3.稳定期4.衰亡期（二）生长曲线对发酵生产的指导意义（略）第9页/共52页 根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：第二节 微生物纯培养群体生长规律缓慢期 对数期 稳定期 衰亡期二、细菌分批培养群体生长规律第10页/共
4、52页第二节 微生物纯培养群体生长规律缓慢期（延迟期、滞留适应期）滞留适应期二、细菌分批培养群体生长规律特 点：分裂迟缓、代谢活跃。产生原因：（2）细胞分裂必需因子的缺乏（1）接种时的机械损伤引第11页/共52页第二节 微生物纯培养群体生长规律缓慢期（延迟期、滞留适应期）4、菌株的遗传性滞留适应期二、细菌分批培养群体生长规律研究滞留适期长短的意义？影响滞留适应期长短的因素1、培养基成分2、接种物菌龄3、接种量第12页/共52页第二节 微生物纯培养群体生长规律对数期（指数生长期）特点：（1）代谢活性强 （2）世代时短而稳定对数生长期二、细菌分批培养群体生长规律第13页/共52页第二节 微生物纯培
5、养群体生长规律对数期（指数生长期）对数生长期二、细菌分批培养群体生长规律见教材P93Nt=2n N0n=3.33(lgNt-lgN0)G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0)n繁殖代数 G世代时(每繁殖一代所需的时间)N0对数生长期开始微生物数量 Nt对数生长期经过时间t后微生物数量第14页/共52页第二节 微生物纯培养群体生长规律稳定期（最高生长量期）最高生长量期特 点：1、细菌数量增加率为0。2、部分细菌大量积累代谢产物。细菌数量增加率为0的原因?二、细菌分批培养群体生长规律第15页/共52页第二节 微生物纯培养群体生长规律衰亡期特 点：菌体活性降低、大量死亡；细胞畸变、自溶 革兰
6、氏染色不稳定衰亡期二、细菌分批培养群体生长规律第16页/共52页第三节 微生物纯培养一、微生物纯培养的概念实验室条件下，由一个微生物细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。第17页/共52页第三节 微生物纯培养二、微生物纯培养技术纯培养基本步骤：稀释平皿法划线法单细胞挑取法纯培养方法 (2)培养(1)分离第18页/共52页第三节 微生物纯培养二、微生物纯培养技术1、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程涂布倾注梯 度 稀 释 过 程10-110-210-310-410-510-6第19页/共52页第三节 微生物纯培养二、微生物纯培养技术4)操作要点：无
7、菌操作稀释平板分离法使用过程中的几个问题1)梯度稀释度的确定：需分离微生物在样品中的数量2)选择菌落接种的依据：a、菌落特征；b、菌体的特征3)微生物纯培养的标准：菌落特征一致性第20页/共52页2、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。第三节 微生物纯培养二、微生物纯培养技术第21页/共52页3、平皿划线法(P图-)用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。第三节 微生物纯培养二、微生物纯培养技术第22页/共52页第三节 微生物纯培养三、目标微生物纯培养筛选的基本思路、待分离样品的确定、培养基的选择
8、、纯化过程环境条件的控制（温度、空气、P、抑制剂）（）第23页/共52页（一）纯培养的保存试管斜面培养基低温、干燥、隔绝空气第三节 微生物纯培养四、纯培养的保存与复壮1、灭菌彻底2、棉塞大小要合适 3、无菌操作保存过程的注意点：防止杂菌污染。第24页/共52页（二）纯培养的衰退与复壮第三节 微生物纯培养四、纯培养的保存与复壮衰退的原因：衰老、变异衰退的表现：生长缓慢优良性状的丧失抗逆性下降衰退的预防：控制继代频率创造良好的培养条件采取有效的保存方式复壮狭义（被动）广义（主动）复壮方法：选优汰劣第25页/共52页第四节 微生物的生活环境极端环境条件对微生物的影响 死 亡环境条件一定范围的变化，影
9、响形态生理生长繁殖温度O2氧化还原电位水分辐射化学药物pH影响微生物生长的主要环境因子第26页/共52页第四节 微生物的生活环境一、温度1、温度对微生物生长的影响微生物的生长温度类型低 温 型中 温 型高 温 型温度对微生物生长的影响高温：蛋白质变性 酶失活 核糖体解体 致死时间、致死温度低温：酶活性下降、新陈代谢缓慢微生物的三种基本温度最低生长温度最高生长温度最适生长温度第27页/共52页第四节 微生物的生活环境2、高温灭菌一、温度高温灭菌湿热灭菌干热灭菌：干燥条件，160维持1-2h。高压蒸汽灭菌法：密闭条件下，水加热蒸发形成高压 的同时产生高温。利用高温杀死菌。巴斯德消毒法：采用60-7
10、0的温度处理15-30min 的消毒方法。间歇灭菌法：100，30-60min 冷却，37培养1d反复三次第28页/共52页第四节 微生物的生活环境3、低温保藏一、温度菌种保存（试管斜面或孢子砂土管）食品保藏特例：流感杆菌、脑膜炎球菌第29页/共52页第四节 微生物的生活环境二、氧气p94专性好氧菌 Eh0.1V，而以0.3-0.4v为宜兼性厌氧菌Eh0.1v行好气呼吸厌氧菌Eh值0.1V以下 耐氧菌微好氧菌第30页/共52页专性好氧菌（专性好氧菌（strict aerobe）必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxi
11、de dismutase）和过氧化氢酶。在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。微好氧菌（微好氧菌（microaerophilic bacteria）只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能兼性好氧菌（兼性好氧菌（facultative aerobe）第31页/共52页耐氧菌（耐氧菌（aerotolerant anaerobe）可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性
12、发酵获得能量。细胞内存在它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。物酶，但缺乏过氧化氢酶。厌氧菌（厌氧菌（anaerobe）分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或
13、甲烷发酵提供；细胞内缺乏循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。还缺乏过氧化氢酶。第32页/共52页第四节 微生物的生活环境三、水分1、水分对微生物生长的影响：细菌最适水的活度值：0.93-0.99 酵母菌最适水的活度值：0.88-0.91 霉菌最适水的活度值：0.802、应用：干燥法保存物品 食品的冷冻干燥水的活度小于0.60-0.70时休眠、部分出现细胞脱水、蛋白质变性(多数微生物)第33页/共52页第四节 微生物的生活环境三、辐 射 辐射：能量通过空间传递的一种物理现象。1、可见光：（400nm800nm）对微生物的
14、作用：光氧化作用：有氧条件下，光线被细胞内色素吸收，使酶或其它敏感成分失活引起的微生物死亡。（3）光氧化作用。（1）能源（2）刺激担子菌子实体形成第34页/共52页2、紫外线：杀菌波长范围：240300nm 杀菌力最强范围：255265nm 三、辐 射紫外线杀菌特点：穿透力弱，用作表面消毒或空气灭菌第四节 微生物的生活环境第35页/共52页 3、电离辐射第四节 微生物的生活环境三、辐 射高能电磁波照射后发生的电离作用。电离辐射对微生物的作用：粮食、果蔬、畜禽产品、饮料以及卫生材料杀菌处理低剂量(500伦琴)：促进生长、诱发变异高剂量（10万伦琴）：杀菌作用实际应用：（X射线、射线等）第36页/
15、共52页第四节 微生物的生活环境四、化学药物1、重金属盐类 杀菌机理：杀菌机理：与带阴电荷的菌体蛋白质结合使其变性（Hg、Ag盐，与细菌酶蛋白的巯基结合）2、有机化合物（酚、醇、醛）蛋白质变性损伤细胞壁和膜抑制酶系统(脱氢酶、氧化酶等)；第37页/共52页第四节 微生物的生活环境四、化学药物杀菌机理：使蛋白质巯基氧化(成二硫基)2RSH+2X RSSR+2XH 杀菌机理：漂白粉Ca(OCl)2及氯气：产生次氯酸盐和原子氧；碘：与酶分子中的酪氨酸结合。3、氧化剂（高锰酸钾、过氧化氢、过氧乙酸）4、卤素（Cl、I常见）第38页/共52页 具有降低表面张力效应的物质。第四节 微生物的生活环境四、化学
16、药物 直接干扰病原微生物的生长繁殖并用于治疗感染性疾病的化学药物。（选择性的杀菌或抑菌）5、表面活性剂（新洁尔灭、消毒宁等）杀菌机理：影响细胞生长、分裂6、化学治疗剂 抑制叶酸合成 如：磺胺类药物等。杀菌机理：抑制蛋白质合成 如：链霉素，红霉素、四环素、氯霉素等抑制肽聚糖合成 如：青霉素，万古霉素等。第39页/共52页第五节：消毒与灭菌第40页/共52页几个基本概念几个基本概念灭菌（灭菌（sterilization）采用强烈的礼花因素是任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能采用强烈的礼花因素是任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。力的措施，称为灭菌。消毒（消
17、毒（disinfection）采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。防腐（防腐（antisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。的措施，称为防腐。化疗（化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质
18、抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。第41页/共52页干热灭菌法（干热灭菌法（dry heat sterilizationdry heat sterilization）焚烧法（焚烧法（incinerationincineration）：）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭物品灭菌，及不怕烧的
19、实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。菌等。干燥热空气灭菌法干燥热空气灭菌法(hot-air oven)(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温至将物品放入烘箱内，然后升温至150150170 170 ，维持，维持1 12 2小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。时间长。第42页/
20、共52页湿热法湿热法(moist heat sterilization)(moist heat sterilization)：特点：温度低、时间短、灭菌效果高特点：温度低、时间短、灭菌效果高原因：原因：1)菌体内含水量越高，则凝固温度越低；菌体内含水量越高，则凝固温度越低；2)蒸汽冷凝会放出潜热；蒸汽冷凝会放出潜热；3)饱和水蒸汽穿透力强；饱和水蒸汽穿透力强；4)湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。性，主要破坏氢键结构。第43页/共52页高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到利用水的沸点随水蒸气压力的增加
21、而上升，以达到100 100 以上高温灭菌的方以上高温灭菌的方法。法。方法：方法：121121（1kg/cm1kg/cm2 2或或1515磅磅/英寸英寸2 2）维持）维持15-20min15-20min。112 112（0.5kg/cm0.5kg/cm2 2或或8 8磅磅/英寸英寸2 2）20-30min20-30min。115 115（0.75kg/cm0.75kg/cm2 2或或1111磅磅/英寸英寸2 2）20-30min20-30min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度例如：例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用生理盐水、营养琼脂等培养基用121
22、 121。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 112。适用：适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。第44页/共52页高 压 蒸 汽 灭 菌 锅注意事项：注意事项：排净冷空气；排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压；灭菌终了，缓慢降压；灭菌结束，趁热取出物品。灭菌结束，趁热取出物品。第45页/共52页消毒p100第46页/共52页煮沸消毒法煮沸消毒法将水加热至将水加热至100100，煮沸，煮沸15min15min30min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的
23、。毒物的目的。巴斯德消毒法（巴斯德消毒法（PasteurizationPasteurization）：）：用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒食品的营养风味，又进行了消毒该法一般是将待消毒的液体食品置于该法一般是将待消毒的液体食品置于6262处理处理30min30min，然后迅速冷却。即可达到消，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。毒目的。低温长时法低温长时法(Low temperature long time,LTLT)(Low temperature long time,LTLT)；62.930min62.93
24、0min处理牛奶处理牛奶高温瞬时法（高温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s71.615s处理牛奶处理牛奶超高温巴斯德灭菌法超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):(Ultrapasteurization):让液体食品停留在让液体食品停留在140140左右左右3-4s3-4s，急剧冷却至急剧冷却至7575，经匀质化后冷却至，经匀质化后冷却至2020。第47页/共52页二、常用的控菌方法二、常用的控菌方法消毒剂消毒剂:可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用
25、的化学试剂可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂.主要主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。防腐剂防腐剂:可以抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学药剂可以抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学药剂.用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也有的用于食品、饮料药品用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也有的用于食品、饮料药品的防腐作用。的防腐作用。但现时消毒剂和防腐剂间的界限已并不很严格但现时消毒剂和防腐剂间的界限已并不很严格.消毒防腐剂的作用机理消毒防腐
26、剂的作用机理一般有下列三种方式一般有下列三种方式:使微生物蛋白质凝固变性使微生物蛋白质凝固变性,发生沉淀发生沉淀.如酒精等如酒精等.破坏菌体的酶系统破坏菌体的酶系统,影响菌体代谢影响菌体代谢.如过氧化氢等如过氧化氢等.降低微生物表面张力降低微生物表面张力,增加细胞膜的通透性增加细胞膜的通透性,使细胞发生破裂或溶解使细胞发生破裂或溶解.如来苏儿等酚如来苏儿等酚类物质类物质.（一）一）消毒剂和防腐剂消毒剂和防腐剂第48页/共52页 类型 名称及使用方法 作用原理 应用范围 醇类70%75%乙醇脱水、蛋白质变性皮肤、器皿 醛类0.5%10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白质变性房间、物品消毒（不适合食
27、品厂）酚类3%5%石炭酸 2%来苏儿3%5%来苏儿破坏细胞膜、蛋白质变性地面、器具皮肤地面、器具氧化剂 0.1%高锰酸钾3%过氧化氢0.2%0.5%过氧乙酸氧化蛋白质活性基团，酶失活皮肤、水果、蔬菜皮肤、物品表面水果、蔬菜、塑料等常用的消毒防腐剂及其应用常用的消毒防腐剂及其应用第49页/共52页常用的消毒防腐剂及其应用常用的消毒防腐剂及其应用类型 名称及使用方法 作用原理 应用范围重金属盐类0.05%0.1%升汞2%红汞0.1%1%硝酸银0.1%0.5%硫酸铜蛋白质变性、酶失活变性、沉淀蛋白蛋白质变性、酶失活非金属器皿皮肤、粘膜、伤口皮肤、新生儿眼睛防治植物病害表面活性剂0.05%0.1%新洁尔灭0.05%0.1%杜灭芬蛋白变性、破坏细胞膜皮肤、粘膜、器械皮肤、金属、棉织品、塑料第50页/共52页常用的消毒防腐剂及其应用常用的消毒防腐剂及其应用类型 名称及使用方法 作用原理 应用范围卤素及其化合物0.20.5mg/L氯气10%20%漂白粉0.5%1%漂白粉2.5%碘酒破坏细胞膜、蛋白质饮水、游泳池水地面水、空气等皮肤 染料2%4%龙胆紫与蛋白质的羧基结合皮肤、伤口 酸类 0.1%苯甲酸 0.1%山梨酸食品防腐食品防腐第51页/共52页感谢您的观看！第52页/共52页