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1、三、无机盐三、无机盐大量元素大量元素(10(10-4-4-10-10-3-3moL/L)moL/L)：P P、S S、K K、MgMg、FeFe、NaNa等；等；微量元素微量元素(10(10-8-8-10-10-6-6moL/LmoL/L）：）：CuCu、ZnZn、MnMn、MoMo、CoCo等，等，须控制量。须控制量。功能：酶的激活剂（功能：酶的激活剂（MgMg2+2+，MnMn2+2+，ZnZn2+2+，CuCu2+2+），维），维持大分子和细胞结构持大分子和细胞结构(Ca,Mg,Fe(Ca,Mg,Fe等等)，调节渗透压，调节渗透压（NaNa+）和无氧呼吸氢受体）和无氧呼吸氢受体(NO(N
2、O3 3-,SO,SO4 42-2-)等。等。第1页/共45页四、四、生长因子（酶的辅酶或辅基）生长因子（酶的辅酶或辅基）1.1.种类种类 维生素（维生素（传统生长因子传统生长因子），嘌呤、卟啉、甾醇、脂），嘌呤、卟啉、甾醇、脂肪酸等。肪酸等。2.2.微生物对生长因子的利用微生物对生长因子的利用（1 1）能合成全部：占大多数（自养型），过量合成）能合成全部：占大多数（自养型），过量合成型型（链霉菌链霉菌VBVB1212）。（2 2）不能或只能部分合成（异养型）不能或只能部分合成（异养型）须须额外添加额外添加对应因子；对应因子；如乳酸菌：添加嘌呤如乳酸菌：添加嘌呤核苷酸；核苷酸；支原体：添加甾醇
3、。支原体：添加甾醇。第2页/共45页注：注：菌不同菌不同需生长因子的种类和数量不同需生长因子的种类和数量不同;同种菌，环境不同同种菌，环境不同需生长因子不同。需生长因子不同。如鲁氏毛霉：在厌氧如鲁氏毛霉：在厌氧需需VBVB1 1+生物素；好氧生物素；好氧自身合成。自身合成。第3页/共45页五、五、水水1.1.分为自由水和结合水。分为自由水和结合水。2.2.水活度水活度(aw)(aw)微生物可实际利用的环境中自由水的量，或微生物可实际利用的环境中自由水的量，或生长环境中水的有效性。生长环境中水的有效性。一定温度和压力下，一定温度和压力下，溶液蒸汽压溶液蒸汽压与同条件下与同条件下纯水蒸汽压纯水蒸汽
4、压的比值。的比值。第4页/共45页几类微生物生长最适几类微生物生长最适 w微生物微生物微生物微生物 ww一般细菌一般细菌一般细菌一般细菌 0.910.91酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌 0.880.88霉菌霉菌霉菌霉菌 0.800.80嗜盐细菌嗜盐细菌嗜盐细菌嗜盐细菌 0.700.70嗜盐真菌嗜盐真菌嗜盐真菌嗜盐真菌 0.650.65嗜高渗酵母嗜高渗酵母嗜高渗酵母嗜高渗酵母 0.600.60 aw=P/P aw=P/P0 0 P P为溶液蒸汽压；为溶液蒸汽压；P P0 0 为纯水蒸汽压为纯水蒸汽压 M M的的a aw w一般在一般在0.60-0.990.60-0.99之间之间第5页/共45页六、能量
5、六、能量化学物质（化能营养型）化学物质（化能营养型）有机物：化能异养型有机物：化能异养型无机物：化能自养型无机物：化能自养型辐射能（光能营养型）：光能自养和光能异养辐射能（光能营养型）：光能自养和光能异养第6页/共45页七、微生物的营养类型七、微生物的营养类型 按碳源、能源、按碳源、能源、氢供体氢供体划分。划分。划分依据划分依据划分依据划分依据营养类型营养类型营养类型营养类型特特特特 点点点点碳源碳源碳源碳源能源能源能源能源氢供体氢供体氢供体氢供体自养型自养型自养型自养型异养型异养型异养型异养型光能营养型光能营养型光能营养型光能营养型化能营养型化能营养型化能营养型化能营养型无机营养型无机营养型
6、无机营养型无机营养型有机营养型有机营养型有机营养型有机营养型 CO CO CO CO2 2 2 2为唯一或主要碳源为唯一或主要碳源为唯一或主要碳源为唯一或主要碳源 有机物为碳源有机物为碳源有机物为碳源有机物为碳源 光为能源光为能源光为能源光为能源 有有有有(无无无无)机物为能源机物为能源机物为能源机物为能源 无机物为氢供体无机物为氢供体无机物为氢供体无机物为氢供体 有机物为氢供体有机物为氢供体有机物为氢供体有机物为氢供体第7页/共45页营养类型营养类型营养类型营养类型碳源碳源碳源碳源能源能源能源能源氢供体氢供体氢供体氢供体光能无机光能无机光能无机光能无机自养型自养型自养型自养型光能有机光能有机
7、光能有机光能有机异养型异养型异养型异养型化能无机化能无机化能无机化能无机自养型自养型自养型自养型化能有机化能有机化能有机化能有机异养型异养型异养型异养型 CO CO CO CO2 2 2 2有机物有机物有机物有机物（或（或（或（或COCOCOCO2 2 2 2）COCOCOCO2 2 2 2有机物有机物有机物有机物光能光能光能光能光能光能光能光能化学能化学能化学能化学能(氧化氧化氧化氧化无机物无机物无机物无机物)化学能化学能化学能化学能(氧化氧化氧化氧化有机物有机物有机物有机物)H H H H2 2 2 2S S S S、水、氢等、水、氢等、水、氢等、水、氢等;藻类、硫细菌藻类、硫细菌藻类、硫
8、细菌藻类、硫细菌有机物，如硫细有机物，如硫细有机物，如硫细有机物，如硫细菌菌菌菌;污水处理污水处理污水处理污水处理氢、氢、氢、氢、H H H H2 2 2 2S S S S、氨等，、氨等，、氨等，、氨等，如如如如硝化细菌硝化细菌硝化细菌硝化细菌、硫、硫、硫、硫化细菌等，物质化细菌等，物质化细菌等，物质化细菌等，物质循环循环循环循环有机物，真菌、有机物，真菌、有机物，真菌、有机物，真菌、原生动物，所有原生动物，所有原生动物，所有原生动物，所有病原菌等病原菌等病原菌等病原菌等第8页/共45页注：注：区分是相对的。区分是相对的。异养异养菌：菌：有机物存在有机物存在可同化可同化COCO2 2。自养菌也
9、能利用有机物。自养菌也能利用有机物。条件变化条件变化营养类型改变，如紫色非硫细菌营养类型改变，如紫色非硫细菌w无有机物：自养无有机物：自养；w有机物存在：为异养；有机物存在：为异养；w厌氧光照：光能营养；厌氧光照：光能营养；w好氧黑暗：化能营养。好氧黑暗：化能营养。第9页/共45页第二节第二节 培培 养养 基基 人工配制，适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物所用的营养基质。人工配制，适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物所用的营养基质。一、配制培养基的原则一、配制培养基的原则二、培养基的类型及应用二、培养基的类型及应用第10页/共45页一一 配制培养基的原则配制培养基的原则 目的明确目的明确 营
10、养协调营养协调 条件适宜条件适宜 经济节约经济节约第11页/共45页1.1.目的明确：目的菌、营养类型、什么用。目的明确：目的菌、营养类型、什么用。2.2.营养协调营养协调 浓度合适，比例协调（如浓度合适，比例协调（如C/NC/N）。）。v如水如水C C源源N N源无机盐生长因子。源无机盐生长因子。v菌不同，菌不同，C/NC/N不同，细菌、酵母菌为不同，细菌、酵母菌为5/15/1，霉菌为，霉菌为10/110/1。v同一种菌，生长阶段不同同一种菌，生长阶段不同，C/NC/N也不同也不同。如谷氨酸棒杆菌，菌体生长。如谷氨酸棒杆菌，菌体生长C/NC/N为为4/14/1；谷氨酸积；谷氨酸积累为累为3/
11、13/1。第12页/共45页3.3.条件适宜条件适宜渗透压，渗透压，pHpH，氧化还原电位和水活度。，氧化还原电位和水活度。（1 1）pHpH细菌：细菌：pH7.0-8.0pH7.0-8.0；放线菌：放线菌：pH7.5pH7.58.58.5；酵母和霉菌：酵母和霉菌：pH4.5pH4.56.06.0。第13页/共45页调调pHpH方法方法外源调节：外源调节：1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH和和HClHCl溶液溶液内内源源调调节节磷酸缓冲剂（磷酸缓冲剂（KHKH2 2POPO4 4和和K K2 2HPOHPO4 4）：产生少量酸、）：产生少量酸、碱时（碱时（pH6.4-7.2pH6.4
12、-7.2内起调节作用）。内起调节作用）。碳酸钙：中和培养过程中产生大量酸。碳酸钙：中和培养过程中产生大量酸。培养基中天然缓冲物质：氨基酸，蛋白质。培养基中天然缓冲物质：氨基酸，蛋白质。第14页/共45页（2 2）氧化氧化-还原电位（还原电位（）v量度还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势。量度还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势。v不同微生物要求不同微生物要求 值不同。值不同。好氧：好氧：0.3-0.4V0.3-0.4V提高通气量或加氧化剂提高通气量或加氧化剂；厌氧：厌氧：+0.1V+0.1V以下以下加还原剂加还原剂（抗坏血酸、（抗坏血酸、NaNa2 2S S等）；等）；兼性厌氧：兼性厌氧：+0.1
13、V+0.1V有氧呼吸，有氧呼吸，-0.1V-0.1V发酵。发酵。第15页/共45页4.4.经济节约经济节约糖蜜（含蔗糖，制糖工业废液）糖蜜（含蔗糖，制糖工业废液）乳清（含乳糖，乳制品工业废液）乳清（含乳糖，乳制品工业废液）麸皮、米糠、豆饼粉、花生饼粉等。麸皮、米糠、豆饼粉、花生饼粉等。5.5.附附-灭菌处理灭菌处理121.3121.3，15-20min15-20min或或115115，35min 35min。不耐高温物质：先不耐高温物质：先过滤除菌过滤除菌或间歇灭菌或间歇灭菌混合。混合。长时间高温长时间高温磷酸盐、碳酸盐磷酸盐、碳酸盐+某些阳离子某些阳离子沉淀。加沉淀。加EDTAEDTA，或分
14、开灭菌，或分开灭菌混合。混合。第16页/共45页6.6.常见的四种培养基常见的四种培养基培养细菌：牛肉膏蛋白胨培养基，培养细菌：牛肉膏蛋白胨培养基，pH7.0-7.2pH7.0-7.2培养放线菌：高氏一号培养基，培养放线菌：高氏一号培养基，pH7.2-7.4pH7.2-7.4培养酵母菌：麦芽汁培养基，自然培养酵母菌：麦芽汁培养基，自然培养霉菌：查氏培养基，培养霉菌：查氏培养基，PDAPDA培养基，培养基，pHpH自然自然第17页/共45页二、培养基的类型及应用二、培养基的类型及应用（一）按成分来源划分（一）按成分来源划分（二）根据物理状态划分（二）根据物理状态划分（三）按用途划分（三）按用途划
15、分第18页/共45页（一）按成分来源划分（一）按成分来源划分1.1.天然培养基天然培养基优点：配制方便、营养多、经济。优点：配制方便、营养多、经济。缺点：成分杂，不稳定，缺点：成分杂，不稳定，重复性差重复性差。例：肉汤、麦芽汁培养基。例：肉汤、麦芽汁培养基。用途：研究和生产。用途：研究和生产。第19页/共45页2.2.合成培养基合成培养基v用途：研究。用途：研究。v优点：优点：重复性强重复性强。v缺点：贵、烦琐、生长慢。缺点：贵、烦琐、生长慢。v例：高氏一号、察氏、葡萄糖铵盐培养基等。例：高氏一号、察氏、葡萄糖铵盐培养基等。3.3.半合成培养基半合成培养基用途：广泛。用途：广泛。例：马铃薯例：
16、马铃薯-葡萄糖培养基。葡萄糖培养基。第20页/共45页（二）根据物理状态划分（二）根据物理状态划分1.1.固体培养基固体培养基（1 1）固化培养基）固化培养基液体培养基液体培养基+琼脂（琼脂（1.5-2%1.5-2%）或明胶（）或明胶（5-12%5-12%）。用途：用途：分离、鉴定、活菌计数及保藏分离、鉴定、活菌计数及保藏。（2 2）天然固体培养基）天然固体培养基（3 3）非可逆性凝固培养基）非可逆性凝固培养基 血清凝固血清凝固或用或用无机硅胶做凝固剂无机硅胶做凝固剂，不能再融化，培，不能再融化，培养致病菌。养致病菌。注：凝固剂有琼脂，明胶，硅胶。注：凝固剂有琼脂，明胶，硅胶。第21页/共45
17、页2.2.半固体培养基半固体培养基液体培养基液体培养基+琼脂琼脂（0.2-0.7%0.2-0.7%），如明胶培养基。，如明胶培养基。用途用途：观察细菌运动、噬菌体效价、厌氧菌的培养：观察细菌运动、噬菌体效价、厌氧菌的培养和保藏。和保藏。3.3.液体培养基液体培养基4.4.脱水培养基脱水培养基 除水分以外，其他已配制好，如虎红培养基（孟除水分以外，其他已配制好，如虎红培养基（孟加拉红加拉红+氯霉素）。氯霉素）。第22页/共45页（三）按用途划分（三）按用途划分1.1.基础培养基基础培养基 含所需基本营养物质。含所需基本营养物质。2.2.加富培养基加富培养基 基础培养基基础培养基+特殊营养物质特殊
18、营养物质(酵母膏酵母膏,组织液组织液,血液，血液，血清等血清等)。用途：培养苛刻菌，分离富集菌。用途：培养苛刻菌，分离富集菌。3.3.鉴别培养基鉴别培养基 基础培养基基础培养基+指示剂（与微生物代谢产物发生显色指示剂（与微生物代谢产物发生显色反应）反应）鉴别菌。鉴别菌。第23页/共45页名称名称名称名称 指示剂指示剂指示剂指示剂 代谢产物代谢产物代谢产物代谢产物 特征性变化特征性变化特征性变化特征性变化 用途用途用途用途 酪素培养酪素培养酪素培养酪素培养基基基基 酪素酪素酪素酪素 胞外蛋白胞外蛋白胞外蛋白胞外蛋白酶酶酶酶 蛋白水解圈蛋白水解圈蛋白水解圈蛋白水解圈 鉴别蛋白酶鉴别蛋白酶鉴别蛋白酶
19、鉴别蛋白酶菌株菌株菌株菌株 H H H H2 2 2 2S S S S试验培试验培试验培试验培养基养基养基养基 醋酸铅醋酸铅醋酸铅醋酸铅 H H H H2 2 2 2S S S S 产生黑色沉产生黑色沉产生黑色沉产生黑色沉淀淀淀淀 鉴别产鉴别产鉴别产鉴别产H H H H2 2 2 2S S S S 的菌株的菌株的菌株的菌株 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝乳糖培乳糖培乳糖培乳糖培养基养基养基养基 伊红、美伊红、美伊红、美伊红、美蓝蓝蓝蓝 酸酸酸酸 反射：绿色反射：绿色反射：绿色反射：绿色金属光泽金属光泽金属光泽金属光泽透射：紫色透射：紫色透射：紫色透射：紫色菌落菌落菌落菌落 鉴别大肠杆鉴别大肠
20、杆鉴别大肠杆鉴别大肠杆菌菌菌菌第24页/共45页纤维素水解圈纤维素水解圈放线菌放线菌霉菌霉菌第25页/共45页4.4.选择培养基选择培养基 （1 1）根据）根据特殊营养要求或理化抗性特殊营养要求或理化抗性设计设计分离菌种。分离菌种。（2 2）分类）分类 加特殊营养物：如纤维素、蛋白质（氮源）或不加氮源加特殊营养物：如纤维素、蛋白质（氮源）或不加氮源（只加甘露醇）；（只加甘露醇）；加抑制剂加抑制剂青霉素青霉素+链霉素（链霉素（抑制细菌和放线菌，分离真菌抑制细菌和放线菌，分离真菌）；）；孟加拉红孟加拉红+链霉素链霉素+金霉素（分离真菌）；金霉素（分离真菌）；结晶紫（杀结晶紫（杀G G+，分离，分离
21、G G-）；）；苯酚或苯酚或重铬酸钾（抑制细菌和真菌生长，低浓度对放线重铬酸钾（抑制细菌和真菌生长，低浓度对放线菌无影响）菌无影响）；制霉菌素（抑制霉菌和皮肤癣菌，分离细菌和放线菌）。制霉菌素（抑制霉菌和皮肤癣菌，分离细菌和放线菌）。第26页/共45页5.5.其他其他分析培养基分析培养基：分析化学物质（如抗生素、维生素）：分析化学物质（如抗生素、维生素）的浓度，或微生物的营养要求。的浓度，或微生物的营养要求。还原性培养基：培养厌氧菌。还原性培养基：培养厌氧菌。组织培养物培养基：含宿主细胞，培养病毒、衣组织培养物培养基：含宿主细胞，培养病毒、衣原体、立克次氏体和某些螺旋体等。原体、立克次氏体和某
22、些螺旋体等。第27页/共45页第三节第三节 菌种分离及保藏技术菌种分离及保藏技术一、纯培养分离技术一、纯培养分离技术固体分离技术、液体培养分离、单细胞分离及其选择培养基分离技术四种。固体分离技术、液体培养分离、单细胞分离及其选择培养基分离技术四种。注：四种技术相辅相成，互相联系。注：四种技术相辅相成，互相联系。第28页/共45页（一）、（一）、利用固体培养基分离纯培养利用固体培养基分离纯培养1.1.稀释倒平皿法稀释倒平皿法和涂布平板法和涂布平板法(10X(10X稀释法，取菌悬液稀释法，取菌悬液+培养基培养基)2.2.平板划线分离法平板划线分离法 (连续划线连续划线,目的是使目的是使cellce
23、ll分散分散)3.3.稀释摇管法稀释摇管法第29页/共45页每只每只9ml9ml无菌水无菌水涂布平板法涂布平板法稀释倒平皿法稀释倒平皿法样品液样品液取取1mL1mL样品样品1.稀释倒平皿法和涂布平板法稀释倒平皿法和涂布平板法第30页/共45页注：注：无菌条件下操作；无菌条件下操作；稀释倒平皿法：温度稀释倒平皿法：温度45-5045-50，长在培养基表面和内，长在培养基表面和内部。部。涂布平板法：长在培养基表面。涂布平板法：长在培养基表面。玻璃刮棒玻璃刮棒(涂布器涂布器)第31页/共45页第32页/共45页2.平板划线法平板划线法第33页/共45页3.3.稀释摇管法稀释摇管法 分离分离厌氧菌厌氧
24、菌，稀释倒平板法的变通形式。，稀释倒平板法的变通形式。v过程过程含培养基的试管（含培养基的试管（5050左右）；左右）；梯度稀释样品，摇匀冷凝。梯度稀释样品，摇匀冷凝。倒倒灭菌液体石蜡灭菌液体石蜡-固体石蜡混合物固体石蜡混合物，培养。，培养。挑单菌落。挑单菌落。第34页/共45页第35页/共45页（二）、（二）、液体培养基分离法液体培养基分离法挑较大细菌、原生动物和藻类。挑较大细菌、原生动物和藻类。用液体培养基梯度稀释用液体培养基梯度稀释培养。培养。同一稀释度，同一稀释度，若大多数试管没有菌生长（若大多数试管没有菌生长（95%95%）有菌生长的试管有菌生长的试管纯培养物。纯培养物。第36页/共
25、45页（三）、（三）、单细胞分离法单细胞分离法显微镜显微镜下直接挑取。下直接挑取。难度难度与个体的大小成反比与个体的大小成反比，藻类、原生动物藻类、原生动物易分离，细菌难分离。易分离，细菌难分离。（四）、选择培养基分离法（四）、选择培养基分离法1.1.直接分离：直接分离：样品中目的菌含量多时。样品中目的菌含量多时。2.2.加富分离：加富分离：样品中目的菌含量少。样品中目的菌含量少。第37页/共45页样样品品液液直接分离直接分离涂布平板法涂布平板法对氨基苯甲酸为唯对氨基苯甲酸为唯一碳源一碳源9ml9ml无菌水无菌水取取1mL1mL样品样品第38页/共45页富集分离富集分离对氨基苯甲酸为唯一碳源的
26、对氨基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基液体培养基对氨基苯甲酸为唯对氨基苯甲酸为唯一碳源一碳源无无对对氨氨基基苯苯甲甲酸酸，不不生生长长有有对对氨氨基基苯苯甲甲酸酸，生生长长第39页/共45页二、菌种保藏技术二、菌种保藏技术 根据根据菌种特性菌种特性和和保藏目的保藏目的进行保存。进行保存。1.1.原则原则（1 1）选良种，最好是）选良种，最好是休眠体休眠体（分生孢子、芽孢分生孢子、芽孢）（2 2）创造休眠环境如）创造休眠环境如低温、干燥低温、干燥、缺氧、缺乏营、缺氧、缺乏营养、添加保护剂等。养、添加保护剂等。第40页/共45页2.2.几种常用保藏方法几种常用保藏方法方法名称方法名称方法名称方法名称主
27、要措施主要措施主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期保藏期保藏期评评评评价价价价冰箱保藏法冰箱保藏法冰箱保藏法冰箱保藏法(斜面斜面斜面斜面)冰箱保藏法（半固体）冰箱保藏法（半固体）冰箱保藏法（半固体）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法石蜡油封藏法石蜡油封藏法石蜡油封藏法*沙土保藏法沙土保藏法沙土保藏法沙土保藏法冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法低温低温低温低温低温低温低温低温低温、缺氧低温、缺氧低温、缺氧低温、缺氧干燥、无营养干燥、无营养干燥、无营养干燥、无营养干燥、无氧、低干燥、无氧、低干燥、无氧、低干燥、无氧、低温、有保护剂温、有保护剂温、有保护剂温、有保护剂各大
28、类各大类各大类各大类细菌、酵母菌细菌、酵母菌细菌、酵母菌细菌、酵母菌各大类各大类各大类各大类*产孢子微生物产孢子微生物产孢子微生物产孢子微生物各大类各大类各大类各大类3636月月月月612612月月月月1212年年年年110110年年年年515515年年年年以上以上以上以上简便简便简便简便简便简便简便简便简便简便简便简便简便简便简便简便有效有效有效有效简便简便简便简便有效有效有效有效第41页/共45页3.3.菌种衰退、复壮菌种衰退、复壮（1 1）衰退）衰退 自发突变自发突变丢失丢失优良生产性状优良生产性状、遗传标记遗传标记。原因：基因突变，传代过多。原因：基因突变，传代过多。衰退表现衰退表现菌
29、落和细胞形态改变；菌落和细胞形态改变；生长慢，产孢少；生长慢，产孢少；抵抗力减弱；抵抗力减弱；代谢物产量或寄生力下降。代谢物产量或寄生力下降。第42页/共45页 防衰退方法防衰退方法控制传代次数；控制传代次数；用不易衰退的细胞传代（如用不易衰退的细胞传代（如单核孢子单核孢子）；）；选合适培养条件及保藏方法；选合适培养条件及保藏方法；（2 2）复壮）复壮 狭义复壮狭义复壮:已衰退已衰退，找出未衰退个体。，找出未衰退个体。广义复壮广义复壮:未衰退前，未衰退前，进行纯种分离、生产性能测进行纯种分离、生产性能测定定提高性能。提高性能。第43页/共45页 复壮措施复壮措施纯种分离：平板划线、涂布、单细胞挑取等。纯种分离：平板划线、涂布、单细胞挑取等。接入寄主内复壮；接入寄主内复壮；淘汰已衰退的个体（理化条件处理淘汰已衰退的个体（理化条件处理杀死衰退个体）。杀死衰退个体）。第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页