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1、湖水污泥微生物中苯酚降解菌的分离与特性测定实验意义 苯酚是染料、农药、医药等行业的重要生产原料和中间体,是工业废水中的常见污染物之一。由于它具有较强的生物毒性,许多国家已将其列入重点污染物名单之中,并且采取各种措施来消除环境中的苯酚污染。而且它的水体污染很难去除。所以在这些措施中,生物修复是一种低成本的环境友好型污染消除方式,它的关键是获得具有苯酚降解功能的微生物。实验目的掌握从土壤中分离苯酚降解菌的方法掌握梯度平板法分离纯化细菌的方法掌握革兰染色的方法实验原理 取湖水污泥，在黑暗环境下的细菌富集富集，将细菌在不断增加苯酚浓度的培养液中培培养养，得到苯酚耐受菌或者降解菌。分离分离出细菌，在苯酚
2、培养液中培养进行4-氨基安替比林分光光度法测定测定，比较苯酚的前后含量确定其是不是降解菌。特性测定本实验只做革兰染色 具体细菌种属的鉴定通过核酸核酸进行实验材料1、耐酚培养基(g/L):酵母膏5.00g,蛋白胨10.00g,NaCl10.00g，蒸馏水1L，PH7.0琼脂16g，121灭菌20min。2、苯酚无机盐培养(PMM,g/L):NH3 NO3 1.00,KH2 PO4 1.50,K HPO4 0.50,NaCl0.50,MgSO4 7H2O 0.10,pH7.07.2,苯酚作为碳源,浓度根据需要添加,固体培养基加2.0%的琼脂.实验材料3、苯酚培养液：苯酚25-75mg，尿素0.1g
3、，微量元素10ml，蒸馏水90ml，PH7.0-7.2，121灭菌20min。4、革兰染色所需试剂 结晶紫、碘液、95%乙醇、复红、香柏油 PH计，温度计，黑布，接种环，酒精灯，显微镜实验方法一、细菌的富集和分离 1、从校园小河污泥中取污泥，称取5.00g加到50ml含有25mg/L苯酚的PMM培养基中。2、于30,.220r/min摇床5d培养后，分别添加3次苯酚无机培养液。隔3天后第一次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至100mg/l；隔3天后第二次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至200mg/l；第三次隔3天后，添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加至300mg/l。3、最后
4、取培养液进行系列稀释后涂布于苯酚浓度为300mg/L的PMM固体培养基平板上，30培养3d后挑取形态上有差异的单菌落,。以上所有培养均用黑布遮盖。实验方法2降酚菌的分离纯化：1、梯度平板法制备梯度平板：12ml不含苯酚的无菌耐酚培养基倾斜于一直径9cm的培养皿中，立即将此培养基协防形成斜面，并刚好遮住底。待凝固后，平放，再加入12ml含苯酚固体培养，完全遮住下层。稀释涂布分离：样品液稀释：将富集的培养基做10倍系列稀释（至10-3）实验方法样品涂液步平板：用无菌1ml移液管分别吸取上述10-3、10-2、10-1和原液依次滴加于相应的平板上，并用无菌涂布棒从平板中央均匀向四周涂布。细菌培养：3
5、0恒温箱培养2天降酚菌的纯化：用无菌接种环挑取高浓度区的菌落接种到PMM培养基上，30恒温培养3天实验方法3.最优降解苯酚细菌鉴定革兰染色显微镜下观察 用接种针挑取少许幼龄培养物，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，风干固定。用结晶紫的混合液染色1-2min后，用水洗。碘液作用1min，水洗，吸干。用95%的乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色(约30s)。用复红液复染约2-3min，水洗，风干，用油镜观察。注意事项1实验人员必须较为清晰的明白实验方法后才可进行实验2取污泥最好在水流缓的地方，污泥位置稍微深一点的，细菌才多，机会才打3用到苯酚时，使用手套、口罩防止中毒。预期结果经过几天培养后培养液变浑浊在涂布分离中能观察到单细胞菌落革兰染色可能为红色也可能为蓝色本实验的困难实验技术不成熟，甚至不会，可能实验结果没有是由于实验技术的原因，所以组员要自己课下学习。实验的未知性：目前分离的苯酚降解菌都是在苯酚污染的环境中的分离出来的，学校湖中的污泥不确定是否会分离出目的菌。苯酚的毒性Thanks