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1、 Protein-protein Interaction 蛋白质-蛋白质相互作用 03/27/2009Protein-Protein Interactions-A Common Theme in Cell Biology 蛋白质-蛋白质相互作用 细胞生物学领域的普遍主题 *DNA *RNA *ProteinCell assembly and function/细胞组装与功能MessengerHeadquarterExecutor Stable,DNA mutationStable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNAVersatile,Protein modificationPro
2、tein-Protein interactionProtein-Other component interaction Protein-Protein InteractionsSingle protein Protein complex Protein complex interaction Protein complex network Cell,Versatile,Dynamic,Accurate regulationCell assembly and functionProtein-Protein InteractionsInteraction Domain -Structural ba
3、sis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础*信号蛋白，调节蛋白以及大多数其他的蛋白质都具 有包括相互作用区域在内的好几个结构域；*有些多肽仅由相互作用区域组成，从而充当蛋白质复合物的核心。Interaction Domain -Structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础*SH2 domain:phosphotyrosine-containing peptides recognition domain。SH2 分布最为广泛，识别特定的含有磷酸化Tyr的多肽模块。SH3
4、SH2Y kinaseSH3SH2SH3pYEEIpYVNVSrc SH2 domain:Grb2 SH2 domain:Interaction domain and Protein interactionSignaling transduction pathwayPhysiological functions of protein interactions Localization 蛋白质的亚细胞定位*蛋白质的亚细胞定位与其 功能密切相关；*涉及：蛋白质-蛋白质相互作用；蛋白质与磷脂的相互作用；*蛋白质的组织特异性与 亚细胞定位的研究是蛋白 质功能研究的起始步骤Protein-protein
5、 interaction can be used to build complex biological systems.蛋白质-蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。（如线粒体内膜呼吸链）Physiological functions of protein interactionsLocalization and TraffickingAberrant interactions can contribute to pathogenesis;错误的相互作用可能导致病理形象的出现。如 Alzheimers disease,beta-淀粉样结构的堆积；Physiological functions
6、 of protein interactionsLocalization and TraffickingInducible protein interaction&posttranslational modifications可诱导的蛋白相互作用与翻译后修饰Dynamic behavior of cells in response to changing conditions is highly dependent on posttranslational modifications;细胞面对不断改变的环境表现出来的动态行为有赖于蛋白质的翻译后修饰以及它带来的蛋白质相互作用的变化。Techni
7、ques and computationElucidation of Protein-Protein InteractionsBiophysical TechniquesMass SpectrometrySurface Plasmon Resonance Atomic Force MicroscopyNMRX-ray CrystallographyHigh Throughput TechniquesLibrary ScreeningDegenerate Peptide LibrariesSpot BlotsCo-IPsGST-pulldownsYeast 2-HybridPhage Displ
8、ayStandard TechniquesCo-IPsGST-pull downsYeast 2-HybridPhage DisplayIn vivo ImagingFRETBRETProtein Interaction NetworksTechniques：Principle,Process,Advantage and DisadvantageGST-Pull downPrinciple:Affinity purification Affinity between Interaction motif/polypeptide and its interaction proteins;Advan
9、tage:Direct interaction/In vitroProcess:Interaction motifGSTImmobilized onGlutathione beadsAffinity column MakingAffinity purificationfrom tissue or cell lysateTechniques：免疫沉淀质量作用定律决定IP的成功度Techniques：免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A(or G)与 IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度；Prot
10、ein A BeadIgG AntigenKdKd*IgG KdAntigenCo-Immunoprecipitation/共免疫沉淀Principle:Affinity purification/亲和纯化Advantage:In vivo(Physiological status)/代表生理状态下的相互作用XYXYCell Cell Lysis andImmunoprecipitation of protein X ZZ细胞裂解与蛋白质X的免疫沉淀Techniques：免疫沉淀（非变性）1.生理活性的保持：a.全程低温操作；b.裂解液中加入蛋白酶抑制剂；2.免疫沉淀的灵敏度取决于Protei
11、n A(or G)与 IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉 淀可以提高灵敏度；Protein A BeadIgG XKdKd*IgG XKdTechniques：免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时，*需要去除盐的干扰，PBS 或其它洗涤缓冲液应可能去除；大量IgG掺入也影响电泳的效果，如脱尾和扩散。检测信号十分微弱时，这种条带的扩散可能导致根本无法获得 信息；Techniques：免疫沉淀（非变性）免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时，大量的IgG掺入样品后导致免
12、疫印迹时出现非特异性条带；对免疫共沉淀的结果分析影响尤其大；IgG目的蛋白用目的蛋白的抗体进行 免疫沉淀，再用免疫印 迹法进行检测；GFP WT YF Mut(6)-+-+-+IP:GFPIB:4G10(pTyr)MTSS1-GFPGFPPDGF115 93 49.8 35.8 29.2198 -+-+-+Reblot:GFP MTSS1-GFPGFP WT YF Mut(6)Techniques：免疫共沉淀（非变性）操作同非变性免疫沉淀，只是检测的是相互作用蛋白；其效率还涉及复合物中蛋白质X，Y，Z的Kd 值。Protein A BeadIgG XYZ Protein A IgG Prote
13、in X*Protein Y Protein ZKdKdKdKdTechniques：免疫共沉淀（非变性）1.免疫复合物中蛋白质X，Y，Z的Kd 值越小，即越稳定，有利于免疫共沉淀的进行;2.免疫沉淀中提高灵敏度的方法同样适用于免疫共沉淀；XYZ Protein A IgG Protein X*Protein Y Protein ZKdKdKdKdTechniques：免疫共沉淀（非变性）细胞裂解液的几点考虑：1.复合物的稳定，提高灵敏度，但会降低特异性；2.针对特定的复合物，细胞裂解液中可能加入磷酸酯酶 抑制剂或者ATP及一些金属离子以维持复合物的稳定；Techniques：免疫共沉淀免疫共
14、沉淀中的非特异性：BAxY细胞裂解蛋白质X的抗体进行免疫沉淀XYXYBAXTechniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 I）BAxY细胞裂解蛋白质X的抗体进行免疫沉淀AX原因：抗体的非特异性Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型I）1.抗体的质量：抗体的特异性；2.尽可能的设置多种阴性对照；一般采用兔子免疫前的血清(pre-immune serum)同时进行免疫沉淀及后续分析;3.使用目标蛋白的多种抗体进行免疫沉淀并比较；4.采用不表达目标蛋白的细胞裂解物同时进行免疫 沉淀并比较；5.增强细胞裂解液的严谨性，降低非特异性
15、；6.检测两种蛋白质的相互作用时，同时用两个蛋白质的抗体进行实验；BAxY细胞裂解蛋白质X的抗体进行免疫沉淀XYXYBXTechniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II）抗原复合物与其它蛋白质的非特异性相互作用；抗原复合物解离XTechniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II）*当 X-Y 的复合物不很稳定或解离常数大时，可以考虑使用细胞 可渗透的交联剂(Cross-linker)XNH2YNH2活性基团活性基团A BAxY细胞裂解蛋白质X的抗体进行免疫沉淀Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设
16、计考虑（类型 II）*当 X-Y 的复合物是瞬间形成的或解离常数大时，可以考虑 使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker)XNH2YNH2活性基团活性基团活性基团活性基团A BAxY细胞裂解蛋白质X的抗体进行免疫沉淀XYTechniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II）研究方案:Affinity purification&MS带Tag的目标蛋白与固相基质偶联目标蛋白带上Tag目标蛋白相互作用蛋白的亲和纯化目标蛋白复合物的SDS-PAGE分离蛋白质条带的切割和酶解质谱与生物信息学分析文献与其他数据库的功能分析实验验证与功能的探索MTSS1 过量表达促进
17、过量表达促进PDGF诱导的背部变皱膜形成诱导的背部变皱膜形成GFPMTSS1-GFPF-actinF-actinGFPGFP研究方案:Co-immunoprecipitation&MSSerum starvationMIM-GFP infected NIH 3T3 cellPDGF stimulationCrosslinker stabilize complexImmunoprecipitation with GFP antibodySDS-PAGEExcise bands and digestionAnalyze by MS and bioinformatics核糖体蛋白代谢酶类热休克蛋白泛
18、肽酶高丰度的细胞骨架蛋白血清蛋白（如果使用是IP亲和的方式）MS after affinity purification鉴定结果中通常包含很多非特异的蛋白质信息去除这些常见的非特异结合的蛋白质（除非它们与你目标 蛋白质功能相关）Transcriptional pattern of of MTSS1 and interacting protein candidates identified by Co-IP&MS http:/mouse.brain-map.org/*利用其他数据库进行的功能分析质谱鉴定数据的分类（Example）F-actin affinity purification&MS
19、鉴定小脑发育相关的F-actin binding protein;Step:(1)F-actin 亲和纯化；(2)MS 数据搜索和初步分析；(3)按鉴定到的蛋白质与F-actin结合的属性分类;(4)按MS鉴定到的蛋白质的生物学功能分类；(5)生物学功能相同或相近的蛋白质聚类,分析复合物组成；(6)根据这些蛋白质在小脑不同发育时期的表达模式聚类；(7)由此将与小脑发育相关的F-actin 结合蛋白与小脑特定发育 时期的功能相联系。部分鉴定到的F-actin 结合蛋白的功能归属Proliferation&Cell deathCell migration&differentiationDendro
20、genesis&axogenesisSynaptogenesisPostnatal development stages of cerebellumTranscription level of MTSS1 in cerebellum*蛋白质功能研究的策略信息学试验分析新蛋白序列同源比较相互作用区域功能区功能伙伴的预测为抗体、siRNA,shRNA等的设计提供预测 试验工具：抗体，克隆，siRNA,shRNA 生理学背景：内源表达和组织及细胞定位筛选相关蛋白验证相关蛋白：1.细胞内共定位；2.去除相互作用区域的影响；3.新蛋白与相关蛋白在功能上的一致性；从找到的新相关蛋白开始，进行新一轮的筛选，
21、建立功能 网络PRD WH2CCDY397Y398 IMD domainF-actin bindingRac bindingCortactin bindingG-actinbindingSrc SH2 binding利用信息学分析新蛋白的结构和功能区，并进行相互作用蛋白的预测Yamagishi et al,J Biol Chem,279,14929,2004;Mattila et al,J Biol Chem,278,8452,2003;Bompard et al,J Cell Sci,118,5393,2005.Lin et al,Oncogene,24,2059,2005.利用亚细胞定位及
22、蛋白质相互作用等信息进利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属行蛋白质功能归属例 1：从免疫共沉淀中得到的蛋白质中筛选重要功能相关蛋白：利用免疫共沉淀方法找到的9个p53(胞浆和核定位胞浆和核定位）结合蛋白 1.GRP-94 GRP-94 2.Alpha-actinin 1 GRP-78 分子伴侣 *3.MCM3 GRP-75 4.GRP-78 5.GRP-75 2 MCM3 DNA复制准许因子*6.Lamin A/C 7.Ezrin/Cytovillin Alpha-actinin 胞浆 8.CD98 antigen 3 Lamin A/C 核纤层 细胞骨架？9.Protein
23、 kinase C Ezrin/cytovilin 胞浆 4 Protein Kinase C 激酶？5 CD98 antigen 跨膜糖蛋白 X 1 例3 Sra1与Nap1参与Rac诱导的片状伪足形成 从牛脑中用传统的柱层析分离到的蛋白质复合物，组分 经质谱鉴定，包括Nap1,Sra-1 homologue，PIR121,WAVE1 and Abi等组分。免疫共沉淀与GST-Pull down验证Rac活化时复合物的存在 Rac活化时Sra-1与Nap1在细胞中的重新定位1.Sra-1 与与Nap1定位于片状伪足顶部定位于片状伪足顶部（免疫荧光）（免疫荧光）RNA 干扰Nap1，Sra1 的表达对Rac功能的影响RNA 干扰Nap1，Sra1 的表达对Rac功能的影响谢谢！