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1、第一节第一节 岛津津LC-10AT型型HPLC操作操作规程程1 目的目的:规范范岛津津LC-10AT型高效液相色型高效液相色谱仪的使用。的使用。范范围:适用于适用于岛津津LC-10AT型高效液相色型高效液相色谱仪的使用。的使用。职责:质检员对本本规程的程的实施施负责。2一、一、系系统组成成 本系本系统由由2个个LC-10ATvp溶溶剂输送送泵（分主（分主/A泵和副和副/B泵）、）、Rheodyne 7725i手手动进样阀、SPD-10Avp紫外紫外-可可见检测器器、N2000色色谱数据数据工工作站作站和和电脑等等组成，另外成，另外还包括打印机、不包括打印机、不间断断电源等源等辅助助设备。3 二
2、、二、准准备1、准准备所需的流所需的流动相，用合适的相，用合适的0.45m滤膜膜过滤，超声脱气，超声脱气20min。2、根据待根据待检样品的需要更品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定合适的洗脱柱（注意方向）和定量量环。3、配制配制样品和品和标准溶液（也可在平衡系准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适配制），用合适的的0.45m滤膜膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）4、检查仪器各部件的器各部件的电源源线、数据、数据线和和输液管道是否液管道是否连接正接正常。常。4 接通接通电源，依次开启不源，依次开启不间断断电源源、B泵、A 泵、检测器器，待，待泵和和检测器自
3、器自检结束后，打开打印机、束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色示器、主机，最后打开色谱工作站工作站。三、三、开机开机5四、四、参数参数设定定1、波波长设定定：在在检测器器显示初始屏幕示初始屏幕时，按，按func键，用数字，用数字键输入所入所需波需波长值，按，按Enter键确确认。按。按CE键退出到初始屏幕。退出到初始屏幕。2、流速流速设定：定：在在A泵显示初始屏幕示初始屏幕时，按，按func键，用数字，用数字键输入所需入所需的流速（柱在的流速（柱在线时流速一般不超流速一般不超过1ml/min），），按按Enter键确确认。按。按CE键退出。退出。3、流流动相比例相比例设定：定：在在A
4、泵显示初始屏幕示初始屏幕时，按，按conc键，用数字，用数字键输入流入流动相相B的的浓度百分数，按度百分数，按Enter键确确认。按。按CE键退出。退出。6四、四、参数参数设定定4、梯度梯度设定定：4.1：在在A泵显示初始屏幕示初始屏幕时，按，按edit键，Enter键；4.2：用数字用数字键输入入时间，按，按Enter键，重复按，重复按func键选择所需功能所需功能（FLOW设定流速，定流速，BCNC设定流定流动相相B的的浓度），按度），按Enter键，用数，用数字字键输入入设定定值，按，按Enter键；4.3：重复上一步重复上一步设定其它定其它时间步步骤；4.4：用数字用数字键输入停止入停
5、止时间，重复按，重复按func键直至屏幕直至屏幕显示示STOP，按按Enter键。按。按CE键退出。退出。7五、五、更更换流流动相并排气泡相并排气泡1：将将A/B管路的吸管路的吸滤器放入装有准器放入装有准备好的流好的流动相的相的储液瓶中；液瓶中；2：逆逆时针转动A/B泵的排液的排液阀180，打开排液，打开排液阀；3：按按A/B泵的的purge键，pump指示灯亮，指示灯亮，泵大大约以以9.9ml/min的流速冲洗，的流速冲洗，3min（可可设定）后自定）后自动停止；停止；4：将排液将排液阀顺时针旋旋转到底，关到底，关闭排液排液阀。5：如管路中仍有气泡，如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排
6、尽。重复以上操作直至气泡排尽。6：如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下拆下连接管，放入接管，放入废液瓶中，液瓶中，设流速流速为5ml/min，按按pump键，冲洗，冲洗3min后再按后再按pump键停停泵，重新，重新接上柱并将流速重接上柱并将流速重设为规定定值。8六、六、平衡系平衡系统1、查看基看基线：1.1：按按N2000色色谱数据工作站操作数据工作站操作规程打开程打开“在在线色色谱工作站工作站”软件，件，1.2：输入入实验信息并信息并设定各定各项方法参数后，方法参数后，1.3：按下按下“数据收集数据收集”页的的 按按钮。9六、六、平衡系平衡系统2、等度
7、洗脱方式等度洗脱方式 2.1：按按A泵的的pump键，A、B泵将同将同时启启动，pump指示灯亮。用指示灯亮。用检验方法方法规定的流定的流动相冲洗系相冲洗系统，一般最少需，一般最少需6倍柱体倍柱体积的流的流动相。相。2.2：检查各管路各管路连接接处是否漏液，如漏液是否漏液，如漏液应予以排除。予以排除。2.3：观察察泵控制屏幕上的控制屏幕上的压力力值，压力波力波动应不超不超过1MPa。如超如超过则可初步判断可初步判断为柱前管路仍有气泡，按柱前管路仍有气泡，按检查管路后再检查管路后再操作。操作。2.4：观察基察基线变化。如果冲洗至基化。如果冲洗至基线漂移漂移0.01mV/min，噪声噪声为25mm
8、ol/L的缓冲液的缓冲液4.每天冲洗柱每天冲洗柱5.稳定进样条件稳定进样条件,调节流动相调节流动相6.采用保护柱采用保护柱40二、二、保留时间缩短保留时间缩短 1.流速增加流速增加2.样品超载样品超载3.键合相流失键合相流失4.流动相组成变化流动相组成变化5.温度增加温度增加1.检查泵检查泵,重新设定流速重新设定流速2.降低样品量降低样品量3.流流 动动 相相 PH值值 保保 持持 在在37.5检查柱的方向检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温柱恒温41三、三、保留时间延长保留时间延长 1.流速下降流速下降2.硅胶柱上活性点变化硅胶柱上活性点变化3.键合相流失键合相
9、流失4.流动相组成变化流动相组成变化5.温度降低温度降低1.管管路路泄泄漏漏,更更换换泵泵密密封封圈圈,排除泵内气泡排除泵内气泡2.用用流流动动相相改改性性剂剂,如如加加三三乙胺乙胺,或采用碱至钝化柱或采用碱至钝化柱3.流流动动相相PH值值保保持持在在37.5检查柱的方向检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温柱恒温42四四、出现肩峰或分叉出现肩峰或分叉 1.样品体积过大样品体积过大2.样品溶剂过强样品溶剂过强3.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.进样器损坏进样器损坏1.用用流流动动相相配配样样,总总的的样样品品体体积
10、积小小于于第第一一峰峰的的15%2.采用较弱的样品溶剂采用较弱的样品溶剂3.更换色谱柱更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件采用较弱腐蚀性条件4.更换烧结不锈钢更换烧结不锈钢,加在线过滤器加在线过滤器,过滤样品过滤样品5.更换进样器转子更换进样器转子43五、五、鬼峰鬼峰 1.进样阀残余峰进样阀残余峰2.样品中未知物样品中未知物3.柱未平衡柱未平衡4.三氟乙酸三氟乙酸(TFA)氧化氧化(肽谱肽谱)5.水污染水污染(反相反相)1.每每次次用用后后用用强强溶溶剂剂清清洗洗阀阀,改改进进阀阀和和样样品品的的清洗清洗2.处理样品处理样品3.重重新新平平衡衡柱柱,用用流流动动相相作作样样品品溶溶剂剂(尤尤其其是是
11、离离子对色谱子对色谱)4.每天新配每天新配,用抗氧化剂用抗氧化剂5.通通过过变变化化平平衡衡时时间间检检查查水水质质量量，用用HPLC级级的水的水44六、六、基线噪声基线噪声 1.气泡气泡(尖锐峰尖锐峰)2.污染污染(随机噪声随机噪声)3.检测器灯连续噪声检测器灯连续噪声4.电干扰电干扰(偶然噪声偶然噪声)5.检测器中有气泡检测器中有气泡1.流动相脱气流动相脱气,加柱后背压加柱后背压2.清清洗洗柱柱,净净化化样样品品,用用HPLC级试剂级试剂3.更换氘灯更换氘灯4.采采用用稳稳压压电电源源,检检查查干干扰扰的的来源来源(如水浴等如水浴等)5.流动相脱气流动相脱气,加柱后背压加柱后背压45七、七
12、、峰拖尾峰拖尾 1.柱超载柱超载2.峰干扰峰干扰3.硅羟基作用硅羟基作用4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道6.死体积或柱外体积过大死体积或柱外体积过大7.柱效下降柱效下降1.降低样品量降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相增加柱直径采用较高容量的固定相2.清洁样品清洁样品,调整流动相调整流动相3.加加三三乙乙胺胺,用用碱碱致致钝钝化化柱柱增增加加缓缓冲冲液液或或盐盐的的浓浓度度降降低低流动相流动相PH值值,钝化样品钝化样品4.更换烧结不锈钢更换烧结不锈钢,加在线过滤器加在线过滤器,过滤样品过滤样品5.更换色谱柱更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
13、采用较弱腐蚀性条件6.连连接接点点降降至至最最低低,对对所所有有连连接接点点作作合合适适调调整整,尽尽可可能能采用细内径的连接管采用细内径的连接管7.用较低腐蚀条件用较低腐蚀条件,更换柱更换柱,采用保护柱采用保护柱46八、八、峰展宽峰展宽 1.进样体积过大进样体积过大2.在进样阀中造成峰扩展在进样阀中造成峰扩展3.数据系统采样速率太慢数据系统采样速率太慢4.检测器时间常数过大检测器时间常数过大1.用用流流动动相相配配样样,总总的的样样品品体体积积小小于第一峰的于第一峰的15%2.进样前后排出气泡以降低扩散进样前后排出气泡以降低扩散3.设定速率应是每峰大于设定速率应是每峰大于10点点4.设设定定时时间间常常数数为为感感兴兴趣趣第第一一峰峰半半宽的宽的10%47八、八、峰展宽峰展宽5.流动相粘度过高流动相粘度过高6.检测池体积过大检测池体积过大7.保留时间过长保留时间过长8.柱外体积过大柱外体积过大9.样品过载样品过载5.增加柱温增加柱温,采用低粘度流动相采用低粘度流动相6.用小体积池用小体积池,卸下热交换器卸下热交换器7.等等度度洗洗脱脱时时增增加加溶溶剂剂含含量量也也可可用用梯梯度洗脱度洗脱8.将连接管径和连接管长度降至最小将连接管径和连接管长度降至最小9.进小浓度小体积样品进小浓度小体积样品48谢 谢！49