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1、第六章第六章 GMP 中的微生物检验中的微生物检验 GMP（good manufacturing practice）：生产质量管理规范 空气中有大量微生物存在，种类多，分布不均匀，通常宿舍空气中含20000个/m3，街道5000个/m3，是传播疾病的主要媒介之一。室内空气的卫生标准夏季菌落总数小于1500个/m3，冬季少于4500个/m3。溶血性链球菌和绿色链球菌夏季少于26/m3，冬季少于36/m3。目前洁净厂房已成为食品和药品生产的基本要求，测定它们的物理和微生物环境条件，已成为质量控制的组成因素。微生物常常是黏附在1020微米粒子上。因此，洁净厂房的微生物学评估是对生产环境监控的不可缺少
2、的指标，它涉及到洁净状况，灭菌消毒状况的有效性。通过对厂房环境的微生物监督和物理分析结果，可判断在该环境中进行生产活动的可靠性。本章主要介绍GMP 中空气洁净度标准、空气洁净度的微生物检测技术，包括采样计划的制定、采样位置的确定、浮游菌的测试、沉降菌的测试209209E E空气洁净度标准空气洁净度标准级别级 别 限 值（m/ft3）0.10.20.30.551357.53.01103507530.010100750300100100010007100001000070100000100000700一、空气洁净度标准一、空气洁净度标准1 英制英制（粒（粒/ftft3 3）：美国联邦标准209E
3、是国际上最通行最著名的洁净室标准，许多国家的洁净度分级基本参照美国标准。2 2 公制公制（粒（粒/L L）：原苏联、澳大利亚标准，分三级。级别最大浓度粒径/m 浓度（粒/L）3.5 0.53.5350 0.53503500 0.535003 3 国际公制国际公制（粒（粒/米米3 3）：采用国际公制的有世界卫生组织（WHO）、欧共体（EEC）、德、日、英、中国。WHOWHO和和EECEEC标准分四级标准分四级 级别大于0.5 m（个/m3）大于5 m（个/m3）浮游菌（个/m3）（A）100350001（B）100350005（C）1万35万2000100（D）10万350万2000500我国的
4、级别标准我国的级别标准(国家食品药品监督管理局国家食品药品监督管理局)级别尘埃最大允许数（个/m3）微生物最大允许数 0.5 m 5 m浮游菌（个/m3）沉降菌90mm平板个/（皿30min）10035000511000035000020001003100000350000020000500103000001050000061800NA 15 虽然国际公制的粒/米3最有通用性，但是在计量监测仪器方面，目前还需用英制中每立方英尺颗粒数（ft3）乘35倍，或用公制中每升颗粒数乘以1000来换算。虽虽然然，洁洁净净室室内内空空气气含含尘尘量量与与含含菌菌量量没没有有一一定定的的比比例例关关系系，但但
5、一一般般认认为为微微粒粒少少的的洁洁净净室室，微微生生物物量量也也较较少少。因因此此，制制药药工工业业为为减减少少微微生生物物污污染染，各各工工序序、各各品品种种采采用用了了不不同同的的洁洁净净度度级级别别。我我国国的的GMP药药品品生生产产各各工工序序的的空气清洁度级别主要是：空气清洁度级别主要是：不能终端高压灭菌的注射剂的调配室，不能终端高压灭菌的注射剂的调配室，100级；级；能终端高压灭菌的注射剂的调配室，能终端高压灭菌的注射剂的调配室，1万级；万级；粉针剂原料药的调配室粉针剂原料药的调配室,100级；级；口服液的调配室口服液的调配室,1万级。万级。二、洁净环境中微生物学二、洁净环境中微
6、生物学警告水平和行动水平的建立警告水平和行动水平的建立 许许多多制制药药厂厂对对洁洁净净环环境境微微生生物物污污染染监监督督参参数数使使用用两两个个水水平平：一一个个是是警警告告水水平平（alert level），一一个个是是行行动动水水平平(action level)。两两个个水平是依据经验资料积累形成的。水平是依据经验资料积累形成的。以以这这两两个个水水平平条条件件下下进进行行无无菌菌生生产产的的药药品品，其其微微生生物物学学质质量量不不会会有有任任何何问问题题，如如果果超超过过这这两个规定的水平，就要判定会造成什么影响。两个规定的水平，就要判定会造成什么影响。1 1 警告水平警告水平 是
7、依据从各个净化厂房或生产步骤得到的经验和资料，一个合适的数值是95%置信值（即每20个结果有一个结果超过此限度），意义是生产中净化厂房和生产步骤情况发生变化，但还未造成直接影响时发出警告。超过警告水平限度要及时监督调查，找出微生物数量增加原因，但不必进行校正工作。许多厂商制定的警告水平可分为两级,并且不同设备的警告水平也可不同。2 2 行动水平行动水平是批准产品的发放水平。是批准产品的发放水平。超过此限度将表示用这样生产步骤生产超过此限度将表示用这样生产步骤生产的药品，微生物质量得不到保证，超过的药品，微生物质量得不到保证，超过行动水平需立即调查，并进行校正。行动水平需立即调查，并进行校正。不
8、同的厂房和设备行动水平都是相同的。目的不同的厂房和设备行动水平都是相同的。目的是保证控制环境的一致性。是保证控制环境的一致性。但由于采样系统、培养基和培养温度不同，所得但由于采样系统、培养基和培养温度不同，所得出的微生物水平的数据会不同。出的微生物水平的数据会不同。三、模拟生产操作步骤微生物学评估三、模拟生产操作步骤微生物学评估模拟生产操作步骤微生物学评估可采用培养基灌封试验。必模拟生产操作步骤微生物学评估可采用培养基灌封试验。必须在无菌生产批结束时立即进行，以证明批生产中无菌保证须在无菌生产批结束时立即进行，以证明批生产中无菌保证条件的状况条件的状况。培养基灌封试验经过培养基灌封试验经过3
9、3次模拟运转合格，该洁净室或控制环次模拟运转合格，该洁净室或控制环境的生产线微生物状况就算合格境的生产线微生物状况就算合格。一般采用大豆消化酪素肉汤培养基进行灌封试验。一般采用大豆消化酪素肉汤培养基进行灌封试验。在在20-2520-25及及30-35 30-35，各培养，各培养7 7天。天。洁净室最重要的污染源是人员，污染率取决于无菌操作区操洁净室最重要的污染源是人员，污染率取决于无菌操作区操作者的操作活动作者的操作活动四、四、空气洁净度的检测方法空气洁净度的检测方法1 1、制定采样计划和采样位置的关键因素制定采样计划和采样位置的关键因素可能与产品接触的空气和表面区域关键区域要比非产品接触区域
10、有较严格监督；高数量人员活动处有较严格监督非肠道使用药瓶装置运作区域，如瓶塞碗中瓶塞的装置，药瓶灌注线上瓶子的补充，人员常规操作涉及的瓶子的消毒建立定期的微生物学监督程序：工作人员接触产品可能性大的区域，无菌产品的无菌操作过程，终端灭菌产品的定期监督采样区域采样频率100级洁净室每次换班100级洁净室供给区域(1万级)每天产品、容器接解区域（10万级）每周2次非产品接触区每周1次终端灭菌药品：产品接触区每周1次 非产品接触区两周1次终端灭菌医用装置：产品接触区两周1次 非产品接触区三周1次无菌肠用品：产品接触区两周1次 非产品接触区三周1次2 2、采样频率、采样频率 采样频率是由该控制区域的重
11、要性以及药品加工步采样频率是由该控制区域的重要性以及药品加工步骤所决定的。骤所决定的。浮游菌测试最少采样点数目浮游菌测试最少采样点数目面积/m2洁净度级别100100001000000验证监测验证监测验证监测小于10 2-3121210-204221220-408321240-100164412100-20040103200-400802064001604010最小采样量：日常监测：最小采样量：日常监测：100级级600L/次，次，10000级级400L/次，次，1000000级级50L/次；环境验证：次；环境验证：100级级1000L/次，次，10000级级500L/次，次，1000000级
12、级100L/次。次。3 3、我国的相关规定、我国的相关规定 我国对医药工业洁净室和控制区，浮游菌我国对医药工业洁净室和控制区，浮游菌（GB/T16293-1996GB/T16293-1996）和沉降菌（和沉降菌（GB/T16294-GB/T16294-19961996）的测试国家标准规定测试方法中制定了的测试国家标准规定测试方法中制定了测试规则，就测试状态、测试人员要求、测试测试规则，就测试状态、测试人员要求、测试时间、采样点数量及布置，最少采样点数目，时间、采样点数量及布置，最少采样点数目，采样次数都有明确规定。采样次数都有明确规定。在满足最少测点数的同时，满足最少培养皿数（在满足最少测点数
13、的同时，满足最少培养皿数（90mm），），100级级14个，个，10000级级2个，个，1000000级级2个个3 洁净室采样点布置：洁净室采样点布置：力求均匀，避免采样点在某局部区域过于稀疏。可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。4 4、设备、设备 撞击式空气微生物采样器撞击式空气微生物采样器 离心式空气微生物采样器离心式空气微生物采样器 狭缝式空气微生物采样器狭缝式空气微生物采样器浮游菌空气采样器浮游菌空气采样器MAS-100 87430MAS-100 87430 5 5 测定方法测定方法（1 1）浮游菌测数）浮游菌测数v 采用计数浓度法，通过收集悬浮在空气中的生物性粒子于专门的培养基
14、经规定时间的培养，在适宜生长条件下让其繁殖到可见菌落时计数，从而判定洁净环境内单位体积空气中的活微生物数。v 被测洁净室的各项状态指标必须在规定值内，且已消过毒v 无论静态和动态测试，都必须符合生产要求。用计数法得出各个培养皿的菌落数。用计数法得出各个培养皿的菌落数。平均浓度（个平均浓度（个/m m3 3）=菌落数菌落数/采样量采样量 如在某测点采样如在某测点采样400400L L，菌落数为菌落数为1 1，则：平均浓度，则：平均浓度=1/0.4=2.5=1/0.4=2.5（个（个/m m3 3）如某测点采样如某测点采样2 2 m m3 3 ，菌落数为菌落数为3 3，则平均浓度，则平均浓度=1.
15、5=1.5（个（个/m m3 3）培养温度在培养温度在30-3530-35度，度，4848h h。每个测点的浮游菌平均浓度判断洁净厂房空气中的每个测点的浮游菌平均浓度判断洁净厂房空气中的微生物数。若某测点的浮游菌平均浓度超过评定标准，微生物数。若某测点的浮游菌平均浓度超过评定标准，则必须对此区域先行消毒，重新采样两次，两次测试则必须对此区域先行消毒，重新采样两次，两次测试结果必须合格。结果必须合格。(2)(2)沉降菌测试沉降菌测试在在灵灵敏敏度度方方面面，采采用用1414cmcm直直径径平平板板达达到到的的净净化度较高。化度较高。C=（D602）/（AT）C：控制区空气中细菌浓度控制区空气中细
16、菌浓度D：沉降细菌沉降细菌4个平板平均数个平板平均数A：平平板板面面积积（cm2）1只只，14cm平板平板=154 cm2T：平板暴露时间（小时）平板暴露时间（小时）五、微生物环境控制程序五、微生物环境控制程序 荷兰的荷兰的RIVM RIVM 监督程序监督程序 在洁净室的微生物环境控制程序包括：设备、装置和在洁净室的微生物环境控制程序包括：设备、装置和人衣服表面取样。人衣服表面取样。不同的设施和环境应用不同的控制程序不同的设施和环境应用不同的控制程序 降低微生物的污染率v屏障：保持物料不暴露在周围环境中。屏障：保持物料不暴露在周围环境中。v吹吹/灌灌/封一体装置体系：封一体装置体系：v隔离装置：防止微生物污染，保护操作隔离装置：防止微生物污染，保护操作人员人员