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1、目目 录录核酸基本知识核酸基本知识PCRPCR的发展史的发展史PCRPCR技术简介技术简介实时实时荧光荧光PCRPCR技术技术实时实时荧光荧光PCRPCR的临床应用的临床应用新冠病毒核酸检测原理新冠病毒核酸检测原理第1页/共31页一、核酸基本知识一、核酸基本知识核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志标志 核酸的分类：脱氧核糖核酸（核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNADNA），核糖核酸），核糖核酸（RNARNA）。）。DNADNA和和RNARNA的区别在于：的区别在于：DNADNA所含的戊糖为脱所含的戊糖为脱氧核糖，而氧核糖，而RNARN
2、A所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，DNADNA含胸腺嘧啶含胸腺嘧啶T T，而，而RNARNA含脲嘧啶含脲嘧啶U U。核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可是单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基进一步水解为戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。（嘌呤碱和嘧啶碱）。第2页/共31页核酸的基本结构核酸的基本结构第3页/共31页遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则第4页/共31页DNAD
3、NA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配对的原则进行半保留复制。补配对的原则进行半保留复制。聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction,PCRReaction,PCR）是一种用于放大扩增特定的）是一种用于放大扩增特定的DNADNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊外的特殊DNADNA复制，复制，PCRPCR的最大特点是能将微量的最大特点是能将微量的的DNADNA大幅增加。大幅增加。第5页/共31页二、二、PCRPCR的发展史的发
4、展史19531953年，沃森和克里克发现了年，沃森和克里克发现了DNADNA双螺旋的结构，双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生开启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学物化学,分子生物学及分子遗传学等各类生命科分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。学的迅速发展。19851985年美国年美国PE-CetusPE-Cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的Mullis Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。应。19881988年初，年初，KeohanogKeohanog改用改用T4 DNAT4 DNA聚合酶进行
5、聚合酶进行PCRPCR，其扩增的，其扩增的DNADNA片段很均一，真实性也较高，片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种只有所期望的一种DNADNA片段。但每循环一次，仍片段。但每循环一次，仍需加入新酶。需加入新酶。第6页/共31页19881988年年Saiki Saiki 等从温泉中分离的等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌一株水生嗜热杆菌(thermus(thermus aquaticus)aquaticus)中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNADNA聚合酶，此酶的发现使聚合酶，此酶的发现使PCRPCR广泛的广泛的被应用。被应用。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术于技术于199619
6、96年由年由美国美国Applied BiosystemsApplied Biosystems公司推公司推出，由于该技术不仅实现了出，由于该技术不仅实现了PCRPCR从从定性到定量的飞跃，而且与常规定性到定量的飞跃，而且与常规PCRPCR相比，它具有特异性更强、相比，它具有特异性更强、PCRPCR污染少、自动化程度高等特点，目污染少、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。前已得到广泛应用。第7页/共31页第一代：手动第一代：手动/机械手式水浴基因机械手式水浴基因扩增扩增用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：在三个温度：PCRPCR的高温变性
7、温度（如的高温变性温度（如9494）低）低温复性温度（如温复性温度（如5858），适温延伸温度（如），适温延伸温度（如7272）。再用一个装有）。再用一个装有PCRPCR标本试管的提篮，用标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是易因疲劳引起差错；而优点是:设备简单，投资设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想程，实验时间短，试验更接近理想PCRPCR反应条件
8、反应条件。第8页/共31页第二代：自动化控制型第二代：自动化控制型PCRPCR 使使用用广广泛泛及及具具有有代代表表性性，采采用用琼琼脂脂糖糖电电泳泳的的方方式式对对P PC CR R产产物物进进行行分分析析，但但存存在在着着操操作作繁繁琐琐、只只适适用用于于定定性性研研究究、交交叉叉污污染染风风险险大大等等不不足足。且且无无法法对对起起始始模模板板准准确确定定量量，无无法法对对扩扩增增反反应应实实时时检检测测。第9页/共31页第三代第三代PCRPCR：实时荧光定量：实时荧光定量PCRPCR为为了了避避免免上上述述传传统统P PC CR R的的缺缺陷陷，并并对对基基因因的的表表达达水水平平进进
9、行行定定量量分分析析，1 19 99 92 2年年诞诞生生了了所所谓谓“第第三三代代P PC CR R 的的荧荧光光定定量量实实时时P PC CR R。所所谓谓r re ea al l-t ti im me e Q Q-P PC CR R技技术术，是是指指在在P PC CR R反反应应体体系系中中加加入入荧荧光光基基因因，利利用用荧荧光光信信号号累累积积实实时时监监测测整整个个P PC CR R进进程程，最最后后通通过过标标准准曲曲线线对对未未知知模模板板进进行行定定量量分分析析的的方方法法。第10页/共31页第四代第四代PCRPCR：数字：数字PCRPCR由于定量由于定量PCRPCR的分析最
10、终结果依赖于的分析最终结果依赖于CtCt值，在这个意义上所谓的值，在这个意义上所谓的“定量定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，下，“数字数字 PCRPCR应运而生。应运而生。数字数字PCRPCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCRPCR，数字，数字PCRPCR可让你能够直接数出可让你能够直接数出DNADNA分子的个数，是对起始样品的分子的个数，是对起
11、始样品的绝对定量。绝对定量。因此特别适用于依靠因此特别适用于依靠CtCt值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、测序结果验证、miRNAmiRNA表达分析、单细胞基因表达分析等表达分析、单细胞基因表达分析等。第11页/共31页三、三、PCRPCR技术简介技术简介 高温可以使双链高温可以使双链DNADNA解链成为单链，解链成为单链，这一过程称为变性。这一过程称为变性。变性后的变性后的DNADNA通过降温可以重新接通过降温可以重新接合为双
12、链，这一过程称为复性。合为双链，这一过程称为复性。PCRPCR技术的基本原理类似于技术的基本原理类似于DNADNA的的天然复制过程，它的特异性取决天然复制过程，它的特异性取决于与靶序列两端互补的寡核苷酸于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。引物。第12页/共31页利利用用温温度度的的升升降降来来控控制制DNADNA的的变变性性和复性。和复性。设设计计引引物物作作为为启启动动序序列列，加加入入DNADNA聚聚合合酶酶、dNTPdNTP（三三磷磷酸酸脱脱氧氧核核甘甘酸酸）等原料完成特定基因的体外复制。等原料完成特定基因的体外复制。周而复始的升降温度进行扩增，周而复始的升降温度进行扩增，每一循环可以使靶
13、序列增加一倍。每一循环可以使靶序列增加一倍。第13页/共31页PCRPCR扩增步骤扩增步骤DNADNA变性（变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板在热作用下，氢键断裂，模板在热作用下，氢键断裂，形成单链形成单链DNADNA。退火（退火（25-6525-65）：系统温度）：系统温度降低，引物与降低，引物与DNADNA模板结合，形成模板结合，形成局部双链。局部双链。延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的酶的作用下，以作用下，以dNTPdNTP（三磷酸脱氧核（三磷酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的甘酸）为原料，从引物的55端端33端延伸，合成与模板互补的端延伸，
14、合成与模板互补的DNADNA链。每一循环经过变性、退火链。每一循环经过变性、退火和延伸，和延伸，DNADNA的含量既增加一倍。的含量既增加一倍。第14页/共31页PCRPCR扩增示意图扩增示意图第15页/共31页3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.Amplicon Cycles Copies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824第16页/共31页常用的技术常用的技术定性定性l电泳检测、放射自显影电泳检测、放射自显影l特异性差、易污染、只能定性特异性差、易污染、只能定性l特异性较好，极易污染、定量
15、特异性较好，极易污染、定量不准确不准确终点法荧光终点法荧光l特异性很好，不易污染，定量特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好线性范围小，重复性不好实时荧光实时荧光l特异性很好，不易污染，线性特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好宽重复性较好第17页/共31页四、实时四、实时荧光荧光PCRPCR技术技术实实时时荧荧光光定定量量P PC CR R：在在P PC CR R反反应应体体系系中中加加入入荧荧光光基基团团，利利用用荧荧光光信信号号积积累累实实时时监监测测整整个个P PC CR R进进程程，最最后后通通过过标标准准曲曲线线对对未未知知模模板板进进行行定定量量分分析析的的方方法法。定
16、定量量P PC CR R仪仪是是在在普普通通P PC CR R仪仪的的基基础础上上加加装装了了荧荧光光激激发发装装置置和和荧荧光光检检测测装装置置，P PC CR R扩扩增增和和检检测测同同时时进进行行，最最终终结结果果不不需需进进行行电电泳泳检检测测，所所以以有有效效地地避避免免了了样样品品间间的的交交叉叉污污染染。第18页/共31页荧光荧光PCRPCR的原理的原理第19页/共31页实时实时荧光荧光PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念扩增曲线：反映扩增曲线：反映PCRPCR循环次数和荧光循环次数和荧光强度的曲线，定量强度的曲线，定量PCRPCR仪每次仪每次PCRPCR扩扩增都会自动记录荧
17、光强度的变化增都会自动记录荧光强度的变化荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，仪信号指数扩增阶段任意位置上，仪器可自动计算，手动设置的原则要器可自动计算，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于。归系数大于。CtCt值：值：PCR PCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经的荧光信号达到设
18、定的阈值时所经过的扩增循环次数。过的扩增循环次数。第20页/共31页实时实时荧光荧光PCRPCR扩增曲线示意图扩增曲线示意图第21页/共31页手工调整荧光阈值示意图手工调整荧光阈值示意图 第22页/共31页CtCt值的意义值的意义CtCt值与重复性值与重复性同一样本在相同条件下同时进行同一样本在相同条件下同时进行9696次次扩增扩增CtCt值与浓度值与浓度不同浓度的模板达到荧光域值时不同浓度的模板达到荧光域值时的的CtCt值不同值不同第23页/共31页PCRPCR扩增的理论模式扩增的理论模式Yn=X*(1+E)Yn=X*(1+E)n n ，0E10E1，E E为扩增效率为扩增效率,X,X为原始
19、模板数为原始模板数,Y,Y为为PCRPCR产物的分子数量产物的分子数量,n,n为周期数。为周期数。模板模板DNADNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即量越多，荧光达到域值的循环数越少，即CtCt值越小。值越小。LogLog浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品据样品CtCt值，就可以计算出样品中所含的模板量。值，就可以计算出样品中所含的模板量。第24页/共31页标准曲线的建立标准曲线的建立 梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等
20、，标准曲线上的间距也相等，说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因原始模板量的准确性。原始模板量的准确性。第25页/共31页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术的特点技术的特点灵敏度高灵敏度高特异性强特异性强快速简便快速简便应用范围广应用范围广第26页/共31页五、实时荧
21、光五、实时荧光PCRPCR的临床应用的临床应用感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断 法医学鉴定法医学鉴定早期诊断早期诊断 病情评估和预后判断病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证第27页/共31页感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 1.1.病原体含量与病情之间的关系病原体含量与病情之间的关系 2.2.病原体含量与用药之间的关系病原体含量与用药之间的关系 3.3.药物及疗法的研究与开发药物及疗法的研究与开发 4.4.新的病原体分子诊断标准新的病原体分子诊断标
22、准 5.5.新的愈后指标新的愈后指标 6.6.传染病发病的监控、预测与预防传染病发病的监控、预测与预防第28页/共31页六、六、新冠病毒核酸检测原理新冠病毒核酸检测原理 对新型冠状病毒（对新型冠状病毒（2019-nCoV2019-nCoV）ORF 1ab ORF 1ab 及编及编码核衣壳蛋白码核衣壳蛋白 N N 或或E E基因的特异性保守序列为靶区基因的特异性保守序列为靶区域，域，进行了双靶标基因的设计，进行了双靶标基因的设计，配以配以PCR PCR 反应液，反应液，在荧光定量在荧光定量 PCR PCR 仪上，仪上，应用实时荧光定量应用实时荧光定量 RT-RT-PCR PCR 检测技术，检测技术，通过荧光信号的变化实现样本新型通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒冠状病毒RNA RNA 的检测。的检测。第29页/共31页Thank You!Thank You!第30页/共31页感谢您的观看！第31页/共31页