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1、一、革兰氏阴性菌克隆载体一、革兰氏阴性菌克隆载体1.移动载体（移动载体（mobilizablevector）1)特点特点i.广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围围ii.DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化进入中间宿主细胞可用直接转化2)结构结构i.RK2质粒的结构质粒的结构a.oriVDNA复制起点复制起点b.DNA复制基因复制基因c.DNA转移基因转移基因d.oriTDNA转移基因转移基因e.药物抗性基因（药物抗性基因（AprKanrTcr
2、）第1页/共36页G+菌的质粒和载体第2页/共36页.移动载体与辅助质粒移动载体与辅助质粒pRK2013:将将RK2中的全部转移基因和中的全部转移基因和Kanr基因插入到基因插入到E.coli的的colE1质粒中构成辅助质粒质粒中构成辅助质粒pRK290:余下部分（余下部分（Apr除外）构成移动载体（约除外）构成移动载体（约20Kb）*当选用当选用E.coli为中间宿主时，必须先将为中间宿主时，必须先将pRK290经过直接经过直接转化引入转化引入E.coli（pRK2013也应转入同一细胞）。当要转移也应转入同一细胞）。当要转移pRK290时，只需将时，只需将E.coli细胞与其他细胞与其他G
3、细胞混合，在细胞混合，在pRK2013的作用下，的作用下，pRK290可可接合转移接合转移至终宿主细胞。至终宿主细胞。3)不相容群不相容群（incompatibilitiygroup）克隆载体）克隆载体.P群：群：RP4RK2RP1R682-5拷贝拷贝.Q群：群：R300BRSF1010R116215-20拷贝拷贝.W群：群：Sa2-5拷贝拷贝4）遗传标记基因遗传标记基因大多数为抗生素标记基因，要注意不同大多数为抗生素标记基因，要注意不同G菌中的表达活性菌中的表达活性第3页/共36页G-细菌中重组质粒的转移第4页/共36页2.非移动载体非移动载体(non-mobilizablevector)1
4、)特点特点：不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体2)实例实例：P4D0105-由由E.coli噬菌体噬菌体P4构建而成，适合于构建而成，适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。和肺炎克蕾伯氏菌。.当辅助噬菌体提供当辅助噬菌体提供P4整合酶时，该载体可整合到整合酶时，该载体可整合到E.coli染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关。合酶无关。.该载体含有一个该载体含有一个virl突变和在引物酶基因突变和在引物酶基因中存在
5、一中存在一个琥珀突变个琥珀突变(am52)，在无抑制子突变的菌株中，该载体，在无抑制子突变的菌株中，该载体不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中(琥珀抑制琥珀抑制子突变体），该载体则可自主复制。子突变体），该载体则可自主复制。第5页/共36页P4D0105载体的结构 第6页/共36页二、革兰氏阳性菌（G+）克隆载体 1.枯草杆菌克隆载体1）B.subtilis作为宿主菌的优点 .芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程.遗传背景较清楚，可直接导入外源DNA.非致病细菌，因而安全.研究结果可用于其它芽孢杆菌.存在各种分泌蛋白质 2）B.subtilis作为宿主菌的
6、缺点 .存在多种蛋白酶基因和相应产物.外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应第7页/共36页3)克隆载体 .复制子来源i)质粒DNA质粒名称大小(kb)标记基因拷贝数来源 pUB4.5Kanr50 金黄色葡萄球菌pE1943.7Eryr10同上pC1942.9Cmlr同上pSA05014.1Strr20-50同上pBC61蜡状芽孢杆菌pLS103B.subtilispFTB14淀粉液状芽孢杆菌pAB124Tcr嗜热脂肪芽孢杆菌pTB1925.8KanrTcr同上pT1814.4Tcr蜡状芽孢杆菌pCW7同上pAM1S.faecalis第8页/共36页ii)噬菌体 10539.2kbB.su
7、btilis温和噬菌体Q1190kb同上第9页/共36页当外源DNA插入上述载体时，105生长的功能丧失,当重组DNA分子转入已含有105的溶源化菌株时，重组DNA分子可以十分有效地插入染色体DNA中。这种技术称之为原噬菌体转移技术第10页/共36页ii.标记基因标记基因)抗生素抗性基因抗生素抗性基因)thy基因基因(三甲氧苄二氨嘧啶三甲氧苄二氨嘧啶)：该基因表达可导致枯草：该基因表达可导致枯草杆菌死亡，但当外源杆菌死亡，但当外源DNA插入该基因后，宿主细胞便插入该基因后，宿主细胞便能存活能存活iii.表达载体的启动子表达载体的启动子常用的有液化芽孢杆菌的常用的有液化芽孢杆菌的-淀粉酶基因启动
8、子和淀粉酶基因启动子和sp2启动子启动子2.其它其它G+克隆载体克隆载体1)枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌色葡萄球菌2)嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒所组建的克隆载体所组建的克隆载体第11页/共36页三、链霉菌克隆载体1.质粒载体质粒名称大小(kb)来源宿主范围拷贝数 SLP1.2 14.5 天兰色链霉菌 窄谱,变青链霉菌 4-5 SCP2(性因子)1-3 pIJ101 8.9 变青链霉菌 广谱(各种载体构建)40-300 pFJ103 20 S.granulorubo
9、r 生二素,金霉素,弗氏链霉菌 pUC6 9.2 S.cepinosue 广谱 30-402.噬菌体载体 C31-天兰色链霉菌的温和噬菌体，长41kb，其中32kb是必须的,具粘性末端的线状DNA分子，可插入约10kb外源DNA，可裂解和溶源化生长。第12页/共36页3.标记基因杂合致死（lethal zygosis,Ltz)lethal zygosis,Ltz)：凡是含有接合质粒的链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种表型也可用于转化体的选择。第13页/共36页第四节真菌分子克隆载体第14页/共36页一、酿酒酵母一、酿酒酵母(
10、Saccharomycea cerevisiae)的的分子克隆载体分子克隆载体1.克隆载体的种类克隆载体的种类1)按复制方式划分按复制方式划分i.自主复制型；自主复制型；ii.整合型（非自主复制型）整合型（非自主复制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)2)按复制子来源划分按复制子来源划分i.附加体型附加体型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其复制起，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒点来自于酿酒酵母的天然质粒-2质粒质粒ii.染色体复制型染色体复制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其，其复制起点来自染色体上的自主复制序列复
11、制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)第15页/共36页酿酒酵母载体的种类和构建 第16页/共36页*若在若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体体YCp-YeastCentrometricplasmid*若在若在YCp或或YRp中插入一段酵母的端粒结构，该中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为质粒称之为YLp-YeastLinearplasmid*若将若将YLp质粒构建成环状分子质粒构建成环状分子,该质粒称之为该质粒称之为pYAC载体载体(YeastArtificialChromosome
12、)3)标记基因标记基因 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如基因作为选择标记，如ARG4ARG4，LEU2LEU2，TRP1TRP1，HIS3HIS3和和URA3URA3。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在靠在E.coliE.coli的转化体中来鉴别的。的转化体中来鉴别的。第17页/共36页
13、2.酵母克隆载体的结构与特点1)穿梭载体，YIp除外2)有适合两种生物的标记基因3)环状或线状DNA 详见下表第18页/共36页载体类型存在方式所需DNA序列标记基因转化频率稳定性（菌落/gDNA）无丝分裂有丝分裂整合型整合与染色体DNAAprTcr10+a+a(YIp5)1-几个拷贝同源URA3附加体型自主复制2质粒AprTcr103-104-b-c(YEp13)多拷贝LEU2复制型自主复制ARSAprTcr103-104-b-c(YRp7)多拷贝TRP1着丝粒型染色体状ARS,CENApr103-104+d+d(YCp19)通常单拷贝TRP1,URA3线型染色体状ARS，CENTRP1，H
14、IS3103-104+e+(YLp21)通常单拷贝TELa.每次细胞分裂仍有约1%的载体DNA从染色体上脱落下来b.在选择培养基中15-20代后，10-30%的转化子丢失载体DNAc.非孟德尔式分离，主要是4+：0-d.无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1%1%酿酒酵母各种载体的特征第19页/共36页3.YIp载体 该类载体只有依靠本身携带的酵母基因与酵母染色体上的同源DNADNA整合到染色体上去。这种转化体十分稳定，但也可能发生第二次同源重组(见图)。可用杂交方法证明整合和二次重组结果（如图所示）。I.宿主DNA;II
15、和III.转化子DNA(10道除外);I和II.LEU基因为探针;III.pBRDNA为探针;E1/道1,4,7;E2/道2,5,8;E1-E2/道3,6,9和10.假设上述YIp质粒长6kb,E1-E2双酶切得2kb和4kb两片段;宿主菌染色体上标记基因用E1酶切得5kb片段,用E2酶切得3kb片段.YIp载体和杂交示意图第20页/共36页载体的整合和重组 第21页/共36页4.YRp载体载体1）酵母染色体复制子和）酵母染色体复制子和ARS的保守性的保守性酵母染色体总长为酵母染色体总长为15,000kb,根据电镜观察结果预计有根据电镜观察结果预计有400个复制起点，根据基因克隆分离个复制起点
16、，根据基因克隆分离ARS的实验结果估计有的实验结果估计有480个个ARS。2）YRp的特点的特点i.高频转化高频转化ii.转化子不稳定转化子不稳定iii.子代细胞质粒分散不均匀子代细胞质粒分散不均匀iv.从酵母转化体中可分离到与转化前相同的质粒从酵母转化体中可分离到与转化前相同的质粒DNAv.可整合到染色体中去，与可整合到染色体中去，与YIp整合过程相同。整合过程相同。第22页/共36页YRp载体和杂交示意图1-YRp12探针;2-URA3探针;3-ARS探针;4-pBR322探针假设宿主菌染色体的ura3基因酶切得3kb片段,而ARS片段酶切得1kb片段.第23页/共36页3）YARp载体（
17、酵母非着丝粒复制质粒）1.4kb酵母DNA（EcoRI片段）自我连接而成，该质粒含有ARS1和TRP1基因该质粒特点:i.高拷贝,100-200/cell;ii.比YRp质粒稳定;iii.可形成核小体;iv.减数分裂以4+:10分离YAR质粒的结构第24页/共36页5.YEp载体1)酵母2质粒 i.结构 ii.结构特点 2质粒的结构 2质粒倒置区的同向和反向重复片段第25页/共36页2）2质粒载体YIp中可插入整个或部分2质粒DNA构成YEp。大多数酿酒酵母菌株中都含有2质粒，YEp复制所需的酶可由2质粒提供。YEp具有YRp载体相同的特点，它还可以与2质粒发生重组。重组质粒不稳定，在无选择压
18、力条件下可很快消失。利用此特点可除去酵母菌株中的天然质粒，即Cir+Ciro当YEp进入宿主细胞后，其转化体内所含DNA可得如下杂交图谱（设YEp为8kb，BamHI有一单切点）1-YEp13探针;2-2质粒探针;3-LEU2探针;4-pBR322探针第26页/共36页6.YCp载体 第一个着丝粒于1980年分离自第三染色体,现已从酿酒酵母菌中分离到多个着丝粒,它们具有如下保守序列:足迹分析技术表明,着丝粒中有一个200-250bp的免受核酸酶作用的DNA序列,可分为四个区。各着丝粒间不发生交叉杂交。YCp载体结构 第27页/共36页7.YLp载体 真核细胞染色体的末端有两个独特的性质：能使染
19、色体保持稳定，能成功地进行DNA复制。这种末端DNA称之为端粒。端粒结构与染色体其余部分的结构是不同的。人为诱发的染色体断裂很不稳定，如果不能修复，将是致死的。环状质粒经限制酶切后的末端极不稳定，极易发生重组，或发生降解，或发生重新环化。最先用于构建YLp的端粒来自四膜虫的核糖体DNA，不同长度的YLp具有不同的特点第28页/共36页8.pYAC载体载体酵母菌人工染色体酵母菌人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)广广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建泛用于构建高等动植物基因组文库的构建,由由YLp经适当改经适当改造后构建成造后构建成pYAC载体。载体。pYA
20、C载体具有以下特点：载体具有以下特点：1）双双TEL位点；位点；2）三个酵母菌遗传标记基因；三个酵母菌遗传标记基因；3）一个一个SUP4基因用于检测重组子基因用于检测重组子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在SUP4基因基因中插入外源中插入外源DNA片段后在转化片段后在转化ade2宿主菌，转化子成红色宿主菌，转化子成红色菌落。菌落。第29页/共36页pYAC载体的结构第30页/共36页9.酵母杂交系统载体主要用于研
21、究DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的相互作用，可用于新基因的克隆。该类载体可分为两类：一类载体中存在一个DNA-结合序列(BD)，它与已知的钓饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（AD），它则与未知或已知的捕猎序列融合。单杂交系统载体双杂交系统载体三杂交系统载体除上述普通型的各类载体外，还有其它不同功能的载体：表达型yeastexpressionplasmid;启动子探针型yeastpromoterplasmid,YPp;杂合型yeasthybridplasmid,YHp,与阅读框架探针型相同。第31页/共36页双杂交系统和载体第32页/共36页二、丝状真菌克隆载体二、丝状真菌克隆载
22、体1.丝状真菌的特点丝状真菌的特点1）属低等真核生物，结构简单，易于培养属低等真核生物，结构简单，易于培养2）基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，如内含子数目、位置等如内含子数目、位置等3）用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，如糖基化、蛋白质外泌如糖基化、蛋白质外泌4）有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚2.丝状真菌克隆载体丝状真菌克隆载体1）自主复制载体自主复制载体，其复制起点来源于以下三类，其复制起点来源于以下三类DNA：i.线粒体质粒，如来自间型脉孢菌线
23、粒体质粒，如来自间型脉孢菌(N.intermedia)线线粒体质粒粒体质粒:pBR322+线粒体质粒线粒体质粒+qa-2+pALS1转化粗糙脉孢菌转化粗糙脉孢菌pALS2（高频转化小质粒）（高频转化小质粒）第33页/共36页ii.类质粒（类质粒（plasmid-like)，如由柄孢壳，如由柄孢壳(Fedospora auseniw)的类质粒的类质粒(2539bp)所构建的克隆载体可达所构建的克隆载体可达1000-9000/g的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序列相同。点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序
24、列相同。iii.染色体复制子染色体复制子)构巢曲霉（构巢曲霉（A.nidulans)复制子复制子pILJ16(5.4kb)+AMA1(6.1kb)ARp1(4.5kb)转化频率转化频率20,000/106原生质体原生质体250ngDNA，可在黑曲霉，可在黑曲霉(A.niger)和米曲霉和米曲霉(A.oryzae)以相同转化频率转化。以相同转化频率转化。10-30copies/单倍体基因组单倍体基因组)玉米黑粉菌玉米黑粉菌(Ustilago maydis)复制子复制子9104/ngDNA，25copies/cell第34页/共36页2）整合型载体）整合型载体由由E.coli克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因构成，转化频率构成，转化频率1-10/gDNA3）标记基因）标记基因 amdsamds乙酰胺酶，乙酰胺酶，dirdir线粒体线粒体ATPATP合成酶，合成酶，qa-2-qa-2-分分解奎尼酸脱氢酶，解奎尼酸脱氢酶，acuDacuD异柠檬酸裂解酶，异柠檬酸裂解酶，HgyHgyr r潮霉潮霉素抗性。素抗性。第35页/共36页感谢您的观看！第36页/共36页