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1、间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测结果分析间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测结果分析王梦涛;赵婵媛;刘小玲;卢春利;王锐【摘【摘 要】要】目的：探讨自身特异性抗体筛查试验间接免疫荧光法(IIF)与确认试验线性免疫印迹法(LIA)检测结果的相关性。方法：用 IIF 法作为抗核抗体(ANA)的筛查试验,用 LIA 法作为抗核抗体谱(ANAs)特异性抗体的确认试验,对自身免疫性疾病组(AID)及非 AID 疾病对照组进行检测分析,并将检测结果分为四组：IIF-ANA+/LIA+组,IIF-ANA+/LIA-组,IIF-ANA-/LIA+组和 IIF-ANA-/LIA-组。结果：在
2、 611 例 AID 组中,IIF-ANA+/LIA+336 例(55%),IIF-ANA+/LIA-116 例(19%),IF-ANA-/LIA+55 例(9%),IIF-ANA-/LIA-104 例(17%)。在 100 例非 AID组中,IIF-ANA+/LIA+2 例(2%),IIF-ANA+/LIA-7 例(7%),IIF-ANA-/LIA+3 例(3%),IIF-ANA-/LIA-88 例(88%),总体符合率 90%。AID 组与非 AID 组自身抗体的检测结果比较差异有统计学意义。IIF-ANA-/LIA+组中,以抗 SSA 抗体、抗Ro-52 抗体、抗 ds-DNA 抗体、抗
3、组蛋白抗体、抗 Jo-1 抗体为主要检测出的阳性自身抗体。AID 组 IIF-ANA+/LIA-中,ANA 检测核型以均质型、斑点型为主,混合核型以均质斑点型为主,荧光检测滴度以 1401320 为主；非 AID 组 IIF-ANA+/LIA-中,核型以斑点型为主,荧光滴度以 1401320 为主。结论：AID 患者可能会出现 IIF-ANA 检测阳性而 LIA-ANAs 检测阴性或者 IIF-ANA 检测阴性而LIA-ANAs 检测阳性,检查除了进行 IIF 筛查 ANA 外,还需进行自身抗体谱的特异性抗体确认实验。%Objective:To explore the correlation
4、of the specificantibody results between screening test of IIF and validation test ofLIA.Methods:IIF method as ANA screening test,using LIA method as thevalidation test of ANAs,Analysis the group of AID and the disease controlgroup of not AID,the test results can be divided into four groups:group IIF
5、ANA+/LIA+,group IIF ANA+/LIA-,group IIF-ANA-/LIA+,group IIF-ANA-/LIA-.Results:In 61 1 cases of AID groups:IIF ANA+/LIA+had 336patients(55%),IIF ANA+/LIA-had 1 1 6 patients(1 9%),IIF ANA-/LIA+had 55 cases(9%),IIF ANA-/LIA-had 104 patients(1 7%).In 100 cases ofthe not AID group:IIF ANA+/LIA+had 2 case
6、s(2%),IIF ANA+/LIA-had 7cases(7%),IIF ANA-/LIA+had 3 cases(3%),IIF ANA-/LIA-have 88 patients(88%),the overall coinci-dence rate was 90%.Two groups autoantibodiesdetection results had significant statistical significance difference.In theIIF ANA-/LIA+group,there are anti SSA antibody,anti Ro-52 antib
7、ody,antids-DNA antibody,anti-histonesantibody,anti Jo-1 antibody as maindetected positive autoantibodies.In the AID groups of IIF ANA+/LIA-,ANAdetection karyotype was given priority to with homogeneous,spots,andmixed karyotype was given priority to with homogeneous spots type,andthe fluorescence det
8、ection of antibody titer was given priority to with1401320;In the not AID group IIF ANA+/LIA-,karyotype was givenpriority to with spot type,the fluo-rescence detection of antibody titer wasgiven priority to with 1401320.Conclusion:In the clinical test of AIDmay appear the IIF test positive for the A
9、NA and LIA-ANAs test negative orIIF-ANA test negative and LIA-AN-As test positive.So in the clinical test ofAID,in addition to the IIF screening test,you also need to do the confirma-tion experiment of autoantibodies spectrum simultaneously,so as to avoida misdiagnosis because ofthe single test.【期刊名
10、称】陕西医学杂志【年【年(卷卷),),期】期】2015(000)011【总页数】【总页数】4 页(P1548-1550,1553)【关键词】【关键词】自身抗体;荧光抗体技术,间接;抗体,抗核;免疫印迹法【作【作 者】者】王梦涛;赵婵媛;刘小玲;卢春利;王锐【作者单位】【作者单位】西安市第五医院检验科 西安 710082;西安市第五医院检验科 西安710082;西安市第五医院检验科 西安 710082;西安市第五医院检验科 西安710082;西安市第五医院检验科 西安 710082【正文语种】【正文语种】中 文【中图分类】【中图分类】R446.6自身抗体检测对于自身免疫性疾病(Autoimmun
11、e disease，AID)的诊断和鉴别诊断具有重要意义，用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence，IIF)检测抗核抗体(Antinuclear antibody，ANA)是目前应用最广泛的自身抗体筛查指标，IIF 法检测 ANA 作为初筛试验，虽然不具有疾病特异性，但由于其测定是针对细胞成分的总抗体，检测敏感性高，对疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义1。目前国内有些实验室在 IIF-ANA 检测结果阴性的情况下，就不再进行 ANA 谱特异性抗体的确认试验检测，只有 ANA 检测结果阳性，才进行 ANA 谱特异性抗体的测定2。还有一些实验室只进行 ANA 谱特异性
12、抗体检测而不检测 ANA，但在实际工作中，IIF 检测 ANA 结果与 LIA 法检测特异性自身抗体结果常不完全符合。我们实验室对 611 例 AID 患者血清抗体同时采用 IIF 法检测 ANA，LIA 法检测 12种特异性自身抗体，比较两种检测方法结果的符合情况，探讨两种方法检测结果的相关性以及是否可以作为相互补充，以提高检测灵敏度的联合检测手段。1 一般资料 收集 2013 年 8 月至 2014 年 8 月在我院确诊为 AID 的住院患者标本共计 611 例，其中男性 151 例，年龄 679 岁，女性 460 例，年龄 288 岁。所有标本同时采用 IIF 法检测 ANA 和 LIA
13、 法检测针对 12 种自身抗原(RNP/Sm、Sm、SSA、Ro-52、SSB、Scl-70、Jo-1、CENP B、双链 DNA、核小体、组蛋白、核糖体 P 蛋白)的自身抗体。同时收集确诊为其它疾病的非 AID 患者 100 例作为对照，其中男性 41 例，年龄 678 岁，女性 59 例，年龄 582 岁。所有 AID患者的诊断均符合国际相关学会的诊断指南，标本均为待测患者清晨空腹静脉血，离心分离冷冻保存的新鲜血清。2 检测方法2.1 用 IIF 法检测 ANA:采用美国 SCIMEDX 公司提供的 ANA 检测试剂盒，以人喉癌上皮细胞(HEp-2)为抗原基质，用间接免疫荧光法(IIF)检
14、测，然后在荧光显微镜下观察荧光模型，抗体滴度1:40 为阳性。2.2 用 LIA 法检测 ANAs：采用 Euroimmun 公司提供的 LIA 法检测 12 种特异性自身抗体试剂盒，检测抗 RNP/Sm 抗体、抗 Sm 抗体、抗 SSA 抗体、抗 Ro-52抗体、抗 SSB 抗体、抗 Scl-70 抗体、抗 Jo-1 抗体、抗 CENP B 抗体、抗双链DNA 抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体、抗核糖体 P 蛋白抗体，实验完全按照操作说明书操作。3 统计学方法 采用 SPSS17.0 统计学软件，IIF 法 ANA 检测阳性而 LIA 法 ANAs检测阴性(IIF-ANA+/LIA-)组、I
15、IF 法 ANA 检测阴性而 LIA 法 ANAs 检测阳性(IIF-ANA-/LIA+)组以及 IIF 法检测 ANA 滴度组间不同疾病患者比例的比较均采用X2 检验，以 P0.05 为差异有统计学意义。1 在 611 例 AID 组患者中 ANA 与 ANAs 检测结果总体符合率为 72%，两者同时阳性所占的比例为 55%，远高于两者同时阴性的 17%，两者差异有统计学意义(2=124.5，P0.01)。在 AID 组和非 AID 组中两种检测方法同时阳性所占的比例分别为 55%和 2%，差异有统计学意义(2=215.5，P0.01)，两组 ANA 检测阳性而 ANAs 检测阴性所占比例分
16、别为 19%和 7%，差异有统计学意义(2=25.13，P0.01)，两组 ANA 检测阴性且 ANAs 检测阳性所占比例分别为 9%和 3%，差异也有统计学意义(2=14.85，P0.01)。AID 组与非 AID 组 IIF 法检测 ANA 和 LIA 法检测 ANAs 的结果总体分布，见表 1、表 2。2 在 AID 组及非 AID 组中 ANA 检测阴性且 ANAs 检测阳性者所检测出的主要自身抗体为抗 SSA 抗体、抗 Ro-52 抗体，其次抗 Sm 抗体、抗 SSB 抗体、抗 ds-DNA 抗体、抗组蛋白抗体、抗 Jo-1 抗体、抗 Scl-70 抗体也有一定的阳性率。58例 II
17、F-ANA 检测阴性且 LIA-ANAs 检测阳性患者中，AID 组与非 AID 组比较，自身抗体的阳性率有统计学意义(P0.01)，两组里抗 SSA 抗体和抗 Ro-52 抗体与其它自身抗体的差异也有统计学意义(P0.01)，见表 3。同时，我们所检测的 AID组中 IIF-ANA+/LIA-组里的荧光模型以细胞核斑点型及均质型为主，而非 AID 组则以细胞核斑点型为主。在 123 例 ANA 检测阳性且 ANAs 检测阴性者中，AID组以斑点型和均质型为主，明显高于非 AID 组，差异有统计学意义(P0.05)，见表 5。自身免疫性疾病总体发病率占世界人口的 3%5%，已成为严重影响人类健
18、康的疾病，自身抗体检测对 AID 诊断和鉴别诊断、病情评估与治疗监测、病程转归与预后判断等都具有重要的临床应用价值3。以 HEp-2 细胞做为基质的间接免疫荧光法检测 ANA 的方法，具有操作简单，敏感性高，且结果易于判读等优点，但ANA 筛查对 AID 诊断没有特异性且该方法自动化程度较低，操作标准化较难4，另外同种特异性抗体可出现不同的荧光染色核型，不同特异性抗体也可出现同样的荧光染色核型5。当我们在 AID 患者中，同时进行 ANA 筛查及 ANAs 确认试验时，由于各方法的抗原所用的基质不同，抗原来源不同，化学实验反应体系不同，实验的敏感性和特异性不同，会出现 ANA 和 ANAs 检
19、测结果不一致的现象，有两种情况需要注意：一种是 IIF 法检测 ANA 阳性而 LIA 法检测 ANAs 阴性的情况，这是因为 ANA 筛查实验具有覆盖 ANA 抗体面广的特点，其抗体针对细胞中的所有抗原成分，而 ANAs 所检测的特异性抗体对疾病的检测具有较高的特异性，但目前免疫学所能检测的特异性抗体仅为自身抗体中的一小部分，仍有大量的未知特异性自身抗体未被认识或未应用于临床检测6，也就是说确认实验检测的是一些最常见的、临床意义已经明确的自身抗体，对于某些少见的、未知的抗体则只能通过荧光方法来检测，而这些少见或未知抗体对疾病诊断也可能有一定的提示意义。另外由于检测时的干扰现象或人体正常免疫反
20、应，以及一些非特异性的抗原会造成荧光检测的阳性，在部分正常人血清检测 ANA 时会出现一定比例的阳性(5%)，但滴度比较低。还有一种情况是 IIF 检测 ANA 阴性而 LIA 法检测 ANAs 阳性的标本，这主要是由于 HEp-2 细胞基质中某些靶抗原的分布不均7，表达含量低(如 RO-52、SSA、JO-1 等)，以及不同固定方法对相关抗原的影响，细胞处理时的某些抗原位点缺失等，这些均可能造成荧光检测的阴性，或者如果 ANA 谱分离的抗原不纯，转运过去的抗原也可能不纯，造成多余条带，导致假阳性的出现。在临床实际工作中，由于认识的误区、局限性及考虑检测成本的因素，许多实验室仅对 IIF 法检
21、测 ANA 阳性的标本才做进一步的 ANAs 特异性抗体确认试验，或者只做 ANAs 确认试验而不做筛查 ANA 的检测，本文通过相关的结果分析显示两种方法检测的总体符合率为 72%，经统计学分析，两种方法的检测结果差异有统计学意义，若只对 ANA 检测阳性的患者再进一步做 ANAs 的确认试验，则会有近 9%左右的漏检率，同样，若只做特异性抗体的确认试验不做 ANA 筛查，也会有将近19%左右的患者漏检。由此表明，在自身抗体的筛查试验为阴性的患者中，仍然存在经确认试验检测证实为阳性的患者，同时也会出现筛查试验阳性而确认试验阴性的情况，为了避免漏检应同时结合各种检查结果，并进行结果的综合考虑，
22、两者不能互相替代。综上所述，对于疑似自身免疫性疾病的患者，无论 IIF 法 ANA 检测初筛试验阳性与否，均需进行针对特异性抗体的确认试验检测，两种方法配合临床诊断，将最大限度的减少自身免疫性疾病患者的漏检率，从而争取最佳治疗时间。【相关文献】1 Pelerson LK，Wells D，Shaw L，et al.Novel method for quantitatine ANAmeasurement using near-infrared imagingJ.Immunol Methods，2009，349:1-8.2 Hahm D，Anderer U.Establishment of HEp-
23、2 cell preparation for automated analysisof ANA fluorescence pattemJ.Cytometry A，2006，69(3):178-181.3 Li Yongzhe.The problems of clinical application and quality assurance in the clinicalapplication and quality assurance of self antibody detection tec-hnologyJ.ChineseJournal of Laboratory Medicine，2
24、006，(9):769-773.4 Sack U，Conrad K，Caemok E，et al.Autoantibody detection using indirenctimmunofluorescence on HEp-2 cellsJ.Ann NY Acad Sci，2009，1173:166-173.5 LiZheng，ChenJie，YuanWenjuan etal.Karyotype distribution of antinuclear antibodiesand its correlation with specific antibodyJ.Labeled Immunoassays and Clinical Medicine，2013，20(6)，433-435.6 Damoiseaux JG，Tervaert JW.From ANA to ENA:How to proceedJ.Autoimmun Rev，2006，5:10-17.7 Bossuyt X，Luychx A.Antidodies to extractable nuclear antigens in antinuclearanybody-negative samplesJ.Clin Chem，2005，51(12):2426-2427.