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1、纳米磁微粒化学发光法定量检测抗核抗体谱的临床应用纳米磁微粒化学发光法定量检测抗核抗体谱的临床应用罗宇维;全树绿;张明娇【摘【摘 要】要】目的 研究全自动、定量纳米磁微粒化学发光法(NM-CLIA)检测抗核抗体谱中 10 种自身抗体的临床应用价值,为抗核抗体谱检测方法 的选择提供参考.方法收集 2016 年 10 月至 2018 年 2 月南方医科大学第三附属医院自身免疫性疾病患者血清 1037 例,健康体检者血清 200 例,用 NM-CLIA 检测血清抗干燥综合征抗原A60(SSA/Ro60)抗体、抗干燥综合征抗原 A 52(SSA/Ro52)抗体、抗干燥综合征抗原 B(SSB/La)抗体、
2、抗双链 DNA(ds-DNA)抗体、抗核糖核蛋白(RNP)抗体、抗史密斯(Sm)抗体、抗着丝点蛋白 B(CENP-B)抗体、抗核糖体 P 蛋白(Rib-P)抗体、抗核糖体(Nuc)抗体、抗组蛋白(His)抗体,同时应用线性免疫印迹法(LIA)平行检测以上抗核抗体谱,对检测结果 进行统计学分析.结果 NM-CLIA 在检测血清中 10 个常见自身抗体时具有较高特异性,均达 95%以上;NM-CLIA 与 LIA 对 10 个自身抗体具有相当的检出率,与文献报道的疾病抗体发生率一致;两种方法在检测抗 SSA60抗体、抗 SSA52 抗体、抗 SSB 抗体、抗 RNP 抗体、抗 CENPB 抗体、抗
3、 Nuc 抗体和抗 His 抗体时,表现出良好的一致性(Kappa0.75,P0.05),而在检测抗 ds-DNA 抗体、抗 Sm 抗体、抗 Rib-p 抗体时一致性一般(0.4Kappa0.75,P0.05);LIA 与第三方试剂检测结果比较差异均有统计学意义(P0.75,P0.05),but the coincidence rate was generallynormal when detecting anti-ds-DNA antibodies,anti-Sm antibodies,andanti-Rib-p antibodies(0.4Kap-pa0.75,P0.05),but the
4、re was significant dif-ference between LIA and the validationreagent(P0.05).Conclusion NM-CLIA showed excellent positive rate andspecificity when detecting ten antinuclear antibodies profile.The twomethods show the excellent qualitative coincidence rate in the detection ofanti-SSA/60 antibodies,anti
5、-SSA/52 antibodies,anti-SSB/La antibodies,anti-rRNP antibodies,anti-CENPB antibodies,anti-Nuc antibodies andanti-His antibodies,but the coincidence rate is generally ordinary whendetecting anti-ds-DNA antibodies,anti-Sm antibodies,and anti-Rib-pantibodie.NM-CLIA test results have better consis-tency
6、 with thevalidation reagent among all discrepant samples.NM-CLIA has theadvantages of full automatic,simple,fast,quantitative,high specificity andrandom combination detection items,which is more worthy of clinicalapplication to to detect antinuclear antibodies profile.【期刊名称】【期刊名称】海南医学【年【年(卷卷),),期】期】
7、2018(029)011【总页数】【总页数】4 页(P1527-1530)【关键词】【关键词】纳米磁微粒化学发光法;抗核抗体谱;线性免疫印迹法【作【作 者】者】罗宇维;全树绿;张明娇【作者单位】【作者单位】南方医科大学第三附属医院风湿免疫科,广东 广州 510630;南方医科大学第三附属医院风湿免疫科,广东 广州 510630;南方医科大学第三附属医院风湿免疫科,广东 广州 510630【正文语种】【正文语种】中 文【中图分类】【中图分类】R446.1抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)是以真核细胞各种细胞成分为靶抗原的器官非特异性自身抗体的总称，抗核内多种物质的特异性
8、抗体谱即为 ANA 谱1。抗核抗体不仅在多种自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AIDs)患者血清中呈不同程度的阳性，并且还存在于在许多疾病如胆汁淤积性肝硬化、糖尿病和某些肿瘤(如卵巢癌、肺癌等)患者的血清中2-5。ANA 谱的检测对于自身免疫性疾病诊断、鉴别诊断、疾病活动性判断及疗效评估等具有重要意义。目前国内实验室对抗核抗体靶抗原确认的方法主要有间接荧光免疫法、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)以及免疫印迹法(lineimmunoassay，LIA)等，但以上方法尚未能全自动化操作及定量检测2。随着免疫学检
9、测技术的发展，ANA 谱的检测已进入定量时代6。具有全自动、定量、随机上样以及检测线性范围宽等优势的纳米磁微粒化学发光免疫分析(magneticnanoparticle chemiluminescence immunoassay，NM-CLIA)检测技术广泛应用于临床样本检测。本研究采用 NM-CLIA 方法对临床不同疾病组样本进行血清抗干燥综合征抗原 A60(anti-Siogren syndrome A60，SSA60)抗体、抗干燥综合征抗原 A52(anti-Siogren syndrome A 52，SSA52)抗体、抗抗干燥综合征抗原B(anti-Siogren syndrome B
10、，SSB)抗体、抗双链 DNA(double-stranded DNA，ds-DNA)抗体、抗核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)抗体、抗史密斯(Smith，Sm)抗体、抗着丝点蛋白 B(centromere protein B，CENPB)抗体、抗核糖体 P蛋白(ribosome P protein，Rib-p)抗体、抗核小体(nucleosome，Nuc)抗体以及抗组蛋白(histone，His)抗体检测，探讨其在抗核抗体谱检测中的临床应用价值。1 资料与方法1.1 一般资料 收集 2016 年 10 月至 2018 年 2 月南方医科大学第三附属医院住院和门诊中诊断为
11、 AIDs 患者的血清 1 037 例，其中住院 732 例，门诊 305 例；男性 306 例，女性 731 例。所有入组样本均已明确诊断为 AIDs，并且剔除重复样本。同时收集南方医科大学第三附属医院健康体检者血清 200 例，男性 67 例，女性133 例，所有受检者的具体临床资料见表 1。表 1 1 237 例受检者的临床资料?1.2 仪器与试剂 NM-CLIA 自身抗体检测系统，包括全自动化学发光分析仪(LumiRay 1260)以及 10 项抗核抗体谱检测试剂(苏州浩欧博生物医药有限公司)。LIA 检测系统，包括 ANA 谱测定试剂盒(德国殴蒙医学诊断股份公司)，殴蒙EUROBlo
12、t One 免疫印迹仪及 EUROBlot 判读软件。第三方验证：酶联免疫吸附法检测试剂盒(殴蒙医学诊断股份公司)及 BioRad-iMark 酶标仪(美国伯乐生命医学产品有限公司)。1.3 方法 NM-CLIA 检测血清 10 项抗核抗体流程严格按照试剂说明书进行，所有抗体检测试剂均在配套的全自动化学发光分析仪(LumiRay 1260)上开展检测。LIA检测 10 项抗核抗体：将膜条放入温育槽内，加入 1.5 mL 样本缓冲液，于室温在摇摆摇床上温育 5 min；吸去温育槽中的液体后，在温育槽中分别加入 1.5 mL 已稀释的血清样本，室温温育 30 min；在温育槽中加入 1.5 mL
13、已稀释的酶结合物(碱性磷酸酶标记的抗人 IgG)，于摇摆摇床上室温温育 30 min；清洗缓冲液清洗膜条 3 次，每次 5 min；在温育槽中加入 1.5 mL 底物液，室温温育 10 min，吸去槽内液体，用蒸馏水清洗膜条 3 次，每次 1 min。结果判断将检测膜条放置在结果判定模板中，风干后判断结果。ELISA 法将稀释血清(1100)、阳性对照、阴性对照以及校准品各 100 L 加入微孔板中，室温温育 1 h；清洗缓冲液洗 4 次，在微孔板中加 100 L 酶标抗人 IgG，室温温育 30 min；清洗缓冲液洗 4 次，在微孔板中加 100 L 底物液，避光显色 15 min；向微孔板
14、中加入 100 L 终止液，在酶标仪上进行吸光度测量。1.4 统计学方法 应用 SPSS21.0 软件进行数据处理。计数资料以率(%)表示，组间比较采用 2 检验，以 P0.05 为差异有统计学意义。两种方法检测结果一致性分析采用 Kappa 检验。当 Kappa0.4，一致性强度较差；0.4Kappa0.75，两者一致性一般；Kappa0.75 两者一致性较好。当两种方法学检测结果一致性强度较差时，差异样本经第三方试剂验证的结果与 NM-CLIA 和 ELISA 检测结果分别采用配对 McNemar 检验，以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 NM-CLIA 在健康体检组中的检
15、测特异性 应用 NM-CLIA 对 200 例健康体检者的血清进行 10 种抗核抗体谱检测，结果显示，NM-CLIA 对 10 种抗核抗体的检测均具较好的特异性，且都在 95%以上，见表 2。2.2 不同检测方法对 AIDs 患者 ANA 谱的检出率比较 应用 LIA 对 1 037 例标本进行平行检测，检测结果显示，NM-CLIA 和 LIA 针对抗 SSA60 抗体、抗 SSA52 抗体、抗 SSB 抗体、抗 ds-DNA 抗体、抗 RNP 抗体、抗 Sm 抗体、抗 CENPB 抗体、抗 Rib-p 抗体、抗 Nuc 抗体、抗 His 抗的检测具有基本相当的抗体检出率，见表3。表 2 NM
16、-CLIA 在健康体检组中的检测特异性(n=200)检测项目 SSA60 SSA52SSB ds-DNA RNP Sm CENP-B Rib-p Nuc His 阳性例数 5 7 1 9 4 5 0 2 4 3 特异性(%)97.5 96.5 99.5 95.5 97.0 97.5 100.0 99.0 97.0 98.52.3 不同方法检测 AIDs 患者 ANA 谱的符合率比较 两种方法在检测抗 SSA60 抗体、抗 SSA52 抗体、抗 SSB 抗体、抗 RNP 抗体、抗 CENPB 抗体、抗 Nuc 抗体和抗His 抗体时，表现出良好的一致性(Kappa 值分别为 0.89、0.86、
17、0.83、0.88、0.90、0.81、0.80)，而在检测抗 ds-DNA 抗体、抗 Sm 抗体、抗 Rib-p 抗体时一致性一般(Kappa 值分别为 0.72、0.64、0.52)，三种抗体均为 SLE 特异性抗体，见表 4。两种方法在检测抗 ds-DNA 抗体、抗 Sm 抗体、抗 Rib-p 抗体时，差异样本分别为 108 例、57 例、89 例，针对差异样本进一步采用第三方试剂(ELISA)开展对比验证，结果显示：NM-CLIA 法与 ELISA 在检测抗 ds-DNA 抗体、抗 Sm抗体、抗 Rib-p 抗体时，检测结果比较差异均无统计学意义(P0.05)；LIA 法与ELISA
18、法在检测以上三种抗体时的结果比较差异均有统计学意义(P0.05)，见表5。表 3 不同检测方法对不同靶抗原患者血清 ANA 检出率比较例（%）靶抗原 NM-CLIA LIASSA60 SSA52 SSB ds-DNA RNP Sm CENP-B Rib-P Nuc His SLE 阳性443(63.7)418(60.1)91(13.1)289(41.0)253(36.4)117(16.8)72(11.7)139(18.5)218(31.4)70(10.1)SS 阳性86(71.2)76(64.4)46(38.9)9(7.6)7(5.9)1(0.8)18(15.3)0(0)1(0.8)0(0)S
19、Sc 阳性44(42.4)23(25.8)1(1.1)3(3.4)5(5.6)0(0)11(12.4)0(0)0(0)0(0)其他阳性15(11.1)18(13.3)1(0.1)2(1.5)12(8.8)1(0.1)2(1.5)1(0.1)1(0.1)9(6.7)SLE 阳性464(66.8)434(62.4)94(13.5)225(32.4)227(32.7)95(13.7)62(8.9)197(28.3)199(28.6)85(12.2)SS 阳性84(67.2)75(63.6)52(44.1)7(5.9)7(5.9)1(0.8)16(13.6)0(0)1(0.1)1(1.8)SSc 阳性
20、44(42.4)24(26.9)1(1.1)3(3.3)5(5.6)0(0)9(10.1)1(0.1)0(0)0(0)其他阳性15(11.1)18(13.3)1(0.1)2(1.5)12(8.8)0(0)2(1.5)1(0.1)1(0.1)12(8.9)表 4 不同方法检测 1 037 份血清 ANA 谱的符合率比较 NM-CLIA 分类 LIA 阳性符合率(95%CI)阴性符合率(95%CI)总符合率(95%CI)Kappa 值 P 值 SSA600.890.05 SSA520.860.05 SSB 0.830.05 ds-DNA 0.720.05 RNP 0.880.05Sm 0.640.
21、05 CENP-B 0.900.05 Rib-p 0.520.05 Nuc 0.810.05 His 阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性 565 42 509 42 122 26 211 16 230 22 79 17 91 8 125 74 173 28 7127 阴性 23 417 26 460 17 872 92 718 47 738 40 901 12 926 15 817 47 789 8921 93.1 89.096.2 92.4 90.793.1 82.4 81.782.9 89.0 87.791.1 91.390.892.3 8
22、2.2 79.285.9 91.9 89.393.7 62.8 59.964.4 86.1 85.888.072.4 70.276.8 94.8 93.697.0 94.7 93.195.2 98.1 97.399.0 88.6 84.587.1 94.0 93.695.3 95.7 94.596.8 98.7 97.699.4 98.2 95.099.8 94.394.196.3 99.1 98.699.7 94.7 92.696.9 93.4 92.993.9 95.9 95.096.989.6 86.890.0 93.3 92.894.3 94.5 92.196.9 98.1 97.99
23、9.0 90.8 83.697.4 92.7 90.095.5 96.4 93.983.2 0.800.05表 5 差异样本经 ELISA 验证结果分析靶抗原 检测方法 例数 ELISA P 值+-NM-CLIA 与 ELISA 比较 LIA 与 ELISA 比较 ds-DNA 140.050.05 Sm 78 7 33 9 710.050.05 Rib-P NM-CLIA+/LIANM-CLIA-/LIA+NM-CLIA+/LIANM-CLIA-/LIA+NM-CLIA+/LIANM-CLIA-/LIA+92 16 40 17 15 74 4 9 1 1 3 6 6 30.050.053 讨
24、论AIDs 是由于免疫耐受功能缺失，机体不能区分自身抗原和外源性抗原转而攻击人体正常的组织和细胞产生病理性免疫应答，最终导致全身组织器官损伤的一类疾病7。AIDs 的诊断以及病情评估很大程度上依赖于患者血清自身抗体的检测，早期正确的诊断对于降低 AIDs 患者的死亡率和致残率、提高患者生活质量具有重要的意义。目前国内大多数临床实验室采用 LIA 检测 ANA 谱，该法为定性检测、检测项目绑定、结果判读主观性强且很难实现随机上样，因此限制了 ANA 谱检测的临床应用价值8。近年来，随着免疫学检测技术的发展，具有全自动、定量、随机上样以及检测线性范围宽等优势的全自动纳米磁微粒化学发光(NM-CLI
25、A)检测技术广泛应用于临床样本检测，这是目前使用的其他检测方法望尘莫及的9-10。本研究结果显示 NM-CLIA 在检测血清中 10 个常见自身抗体时具有较高特异性，均达 95%以上，并与 LIA 具有相当的检出率，以往文献报告相关抗体的发生率及特异性基本一致；两种方法在检测抗 SSA60 抗体、抗 SSA52 抗体、抗 SSB 抗体、抗 RNP 抗体、抗 CENPB 抗体、抗 Nuc 抗体和抗 His 抗体时，表现出良好的一致性(Kappa0.75)，而在检测抗 ds-DNA 抗体、抗 Sm 抗体、抗 Rib-p 抗体时一致性一般(0.4Kappa0.75)，针对差异样本进一步采用第三方试剂
26、(ELISA)开展对比验证，结果显示 NM-CLIA 与 ELISA 在检测抗 ds-DNA 抗体、抗 Sm 抗体、抗 Rib-p 抗体时具有可比性(P0.05)，而 LIA 则相反。以上结果可能是由于11：(1)反应原理的不同所引起结果差异：与 LIA 方法学相比较，NM-CLIA 中采用了生物素-亲和素放大系统保证了抗原的包被效率，小分子抗原经生物素化后，与亲和素修饰的纳米级磁微粒结合，使小分子抗原的三维结构充分展现出来，提高了检测敏感度；(2)反应体系的不同所导致的检测性能差异：LIA 法将多种靶抗原同时包被在一条硝酸纤维膜上，在同一反应体系中无法保证抗原抗体最充分的结合；而NM-CLI
27、A 为均一液相反应体系，具备更好的反应效率以及更彻底的清洗步骤，从而提高反应体系的特异性。与 NM-CLIA 相似，ELISA 具有独立的反应体系，能保证反应充分完成。综上所述，随着 NM-CLIA 的不断成熟，其在自身免疫性疾病诊断方面的应用，必将大大加快对各种自身抗体谱的检测速度和提高检测结果的准确性。参考文献1Yoo IY,Oh JW,Cha HS,et al.Performance of an automated fluorescenceantinuclear antibody image analyzerJ.Ann Lab Med,2017,37(3)240-247.2Birtane
28、 M,Yavuz S,Tatekin N.Laboratory evaluation in rheumaticdiseasesJ.World J Methodol,2017,7(1)1-8.3Amin K,Rasool AH,Hattem A,et al.Autoantibody profiles in autoimmunehepatitis and chronic hepatitis C identifies similarities in patients withsevere diseaseJ.World J Gastroenterol,2017,23(8)1345-1352.4Tan
29、L,Zhang Y,Jiang Y,et al.The clinical significance of anti-mitoticspindle apparatus antibody(MSA)and anti-centromereantibody(ACA)detected in patients with small cell lungcancer(SCLC)J.Am J Clin Exp Immunol,2017,6(2)21-26.5Chatterjee M,Hurley LC,Levin NK,et al.Paraneoplastic antigens asbiomarkers for
30、early diagnosis of ovarian cancerJ.Gynecol OncolRep,2017,20(4)1-19.6仲人前,杨再兴.自身抗体检测进入定量检测时代J.中华检验医学杂志,2014,37(8)561-563.7Nagy G,Huszthy PC,Fossum E,et al.Selected aspects in the pathogenesisof autoimmune diseasesJ.Mediators Inflamm,2015,2015(3)351732.8Hanly JG,Su L,Farewell V,et al.Comparison between
31、 multiplex assays forautoantibody detectionin systemic lupus erythematosusJ.J ImmunolMethods,2010,358(1-2)75-80.9Zafrir Y,Gilburd B,Carrasco MG,et al.Evaluation of an automatedchemiluminescent immunoassay kit for antinuclear antibodies inautoimmune diseasesJ.Immunol Res,2013,56(2-3)451-456.10Bentow C,Lakos G,Rosenblum R,et al.Clinical performance evaluation ofa novel,automated chemiluminescent immunoassay,QUANTAFlash CTDScreen PlusJ.Immunol Res,2015,61(1-2)110-116.