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1、抗磷脂抗体所针对的抗原 2GP1 的分子克隆表达及临床应用2009-10-17杨程德陈顺乐沈南顾越英鲍春德摘要目的：用分子生物学的方法克隆表达抗磷脂抗体所针对的抗原 2GP1，并研究抗 2GP1 抗体的临床意义。方法：用 RT-PCR 的方法从肝细胞中克隆出 2GP1cDNA，并构建重组载体，用纯化的重组 2GP1 为抗原建立抗 2GP1 的 ELISA 方法。结果：IgG 类抗 2GP1与 IgG 类抗心磷脂抗体的检测结果间呈正相关关系(r0.667)，抗 2GP1 抗体阳性组患者与阴性组患者的血栓等临床症状的发生率有显著性差异(P0.002 408)。结论：抗 2GP1 抗体的检测对自身免
2、疫性疾病患者的血栓等症状有预测价值，其特异性比常规抗心磷脂抗体的方法为高。关键词抗磷脂抗体综合征抗磷脂抗体抗原CLONING AND EXPRESSION OF 2GP1 RECOGNIZED BY ANTIPHOSPHOLIPID ANTIBODIES，AND ITSCLINICALINVESTIGATIONYangChengde,ChenShunle,ShenNan,GuYueying,BaoChunde.Renji Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai,200001.AbstractObjective:To study
3、cloning and expression of 2GP1 which recognizedby antiphospholipid antibodies,and the clinical significance of anti-2GP1antibodies in patients.Methods:By using reverse transcription-PCR method,the human2GP1cDNAfromlivercellswasobtainedanditsexpressionvectorwasconstructed.Using recombinant 2GP1 as an
4、tigen,anti-2GP1 ELISA method wasestablished.Results:The values of IgG anti-2GP1 and IgG aCL ELISA assay showed asignificant correlation(r0.667).The presence of anti-2GP1 antibodies wasassociated with anincreased frequency of historyofthrombosis(P 0.002408).Conclusion:Detection of anti-2GP1 antibodie
5、s in patients is of potentialvalue for predicting the thrombosis and other APS-associated symptoms.Key wordsantiphospholipid syndromeantiphospholipid antibodyantigen抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome，APS)的主要临床表现为反复的动脉、静脉血栓、多发性流产、血小板减少症等症状。临床上可分为原发性及继发性 APS，后者可继发于多种自身免疫性疾病。APS 患者血清中存在中高滴度的抗磷脂抗体(antip
6、hospholipidantibodies，aPL)，临床上常用检测 aPL 的方法有狼疮抗凝因子及抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibodies，aCL)的检测1。1990 年 McNeil2发现用离子交换及磷脂亲和纯化的 aCL 不能在无小牛血清的 ELISA 反应系统中与反应板上的心磷脂结合，当反应系统恢复血清成分后，aCL 也恢复了与心磷脂结合的活性，成分分析表明起这种作用的是血浆中的磷脂结合蛋白-2GP1(2 glycoprotein l)，以后有些实验揭示 aCL 所直接针对的抗原可能不是磷脂而是与心磷脂结合的 2GP1。为了研究抗 2GP1 抗体的临床意义，本
7、研究构建了重组质粒，用重组 2GP1 建立了抗 2GP1 抗体检测方法并初步探讨其临床意义。1材料和方法1.1PCR 引物设计：根据Steinkasserer 等3报道的 2GP1 cDNA 全长序列，设计了克隆全长的引物，设计的两对引物分别位于 2GP1 cDNA 的 16-39 及 1 040-1 062 位碱基，并在引物 5端分别添加 BamHI 及 EcoRI 的内切酶位点序列，引物由中国科学院细胞研究所合成。1.2 2GP1 cDNA 的逆转录合成、重组质粒的构建：取新鲜胎肝10 mg 抽取总 RNA。逆转录反应及重组质粒的构建见文献4。1.3重组质粒转化：参照氯化镁法4稍加改进。1
8、.4高效表达克隆筛选：挑取带有插入目的基因的克隆分别进行培养，当 A 值 0.6 左右时加入诱导剂 IPTG，使终浓度为0.1 mmol/L，分别于0 小时、1 小时、2 小时、3 小时、4 小时取样，SDS-PAGE 电泳检测重组蛋白表达。1.5测序：抽提高效表达克隆质粒，切下cDNA插入子，与测序质粒Blue SKII连接，用ABI373A自动测序仪进行标记终止子法测序。1.6重组蛋白的纯化：用谷胱甘肽-Sepharose 4 B 亲和层析柱(Promega)纯化，具体方法按操作说明。1.7研究对象：血清标本获自本院门诊及住院病人。共选择了 112 例病例供研究，其中系统性红斑狼疮(SLE
9、)84 例(有 8 例符合继发性抗磷脂抗体综合征的诊断)，原发性抗磷脂抗体综合征 3 例，多发性流产 7 例(aCL 阳性)，其它结缔组织疾病 18 例。SLE 等疾病的诊断符合美国风湿病学会制订的 1982 年系统性红斑狼疮分类的修订标准 及其它分类标准5，6。血栓的诊断依据相关的临床表现及血管造影、CT、MRI 等相关检查。1.8抗心磷脂抗体测定：具体方法见文献7。1.9抗 2GP1 抗体测定8：96 孔酶标反应板经 60Co 处理，使其表面氧化(剂量为 10 kGy，第二军医大学辐照中心)，重组 2GP1 的包被浓度为 2 mg/L(包被夜为 pH 9.6 碳酸氢盐缓冲液)，100 l/
10、孔包被反应板，4 过夜，pH 7.4，PBS-Tween 20 洗板，5 分钟/次3，用含5%的牛血清白蛋白-0.3%明胶液封闭 37 2 小时，pH 7.4 PBS-Tween 20 洗板，5 分钟/次3，加入 1100 稀释的待检血清(用含 1%牛血清白蛋白-0.3%明胶稀释)，37 1 小时后，pH7.4，PBS-Tween 20 洗板，5 分钟/次3，分别加入稀释的酶标抗体HRP-羊抗人 IgG 37 1小时后，pH 7.4 PBS-Tween 20洗板，5 分钟/次3，加入底物 TMB 显色，450 nm 测 A 值。结果判定：当样品的A 值/阴性对照平均 A 值(P/N)2.1 时
11、为阳性。2结果2.1 2GP1cDNA PCR扩增结果：电泳结果在 1 000 bp1 100 bp间可见一清晰条带，与目的基因 1 062 bp 相符。2.2测序：核苷酸的测序结果与文献报道的一致。2.3 2GP1 重组质粒诱导表达的结果：空白 pGEX-2T 质粒经诱导后，在 26 kD 处有谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的浓集蛋白条带，重组 2GP1 质粒经诱导可见在 64 kD 处有一浓集的蛋白条带，与目的蛋白的大小一致。2.4IgG 类抗 2GP1 抗体与 aCL 检测结果的关系：为了研究抗 2GP1 抗体与 aCL 之间的关系，每一份样本均作抗 2GP1 抗体及 aCL 的检测，IgG 类抗 2GP1 与 IgG 类 aCL 的检测结果见图 1。两种方法的 IgG 类抗 2GP1 与 IgG 类 aCL 的检测结果呈正相关关系(r0.667)，如按常规 aCL ELISA 法检测的结果，可把患者血清分为四组：阴性(3 s)、低度阳性(3 s5 s)、中度阳性(5 s10 s)、高度阳性(10 s 以上)，IgG 抗 2GP1 的阳性率(%)分别为 1.6%(1/61)、22.2%(4/18)、68.2%(15/22)、72.2%(8/11)。