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1、流式细胞术的临床应用一、在肿瘤学中的应用这是 FCM 在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶 PI)染色后对细胞的 DNA 含量进行分析，PI 可以与细胞内 DNA 和 RNA 结合，采用RNA 抑制剂将 RNA 消化后，通过流式细胞术检测到的与 DNA 结合的 PI 的荧光强度直接反映了细胞内 DNA 含量的多少。由于细胞周期各时相的 DNA 含量不同，通常正常细胞的 G1/GO 期具有二倍体细胞的 DNA 含量(2 N)，而 G2/M期具有四倍体细胞的 DNA 含量(4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。因此
2、，通过流式细胞术 PI染色法对细胞内 DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为 G1/GO期，S 期和 G2/M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA 含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的 DNA 二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞 DNA 含量的异常改变，FCM 可精确定量 DNA 含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志
3、，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA 非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用FCM 在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA 非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM 分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞 DNA 倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FC
4、M 不仅可对恶性肿瘤 DNA 含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤 DNA 分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从 DNA 直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。3、FCM 在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA 含量及特异性抗原基因(如 bcl-2,Fas 等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用 Annexin V 结合PI 或 7-AAD双染色法进行细胞凋亡
5、分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS 特异的 Annexin-V探针所标记。PS 转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或 7-AAD 对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin-V结合 PI 或 7-AAD 进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚期细胞可被
6、Annexirr V 和 PI 或 7-AAD 同时染色。多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因，FCM 对多药耐药基因(MDR-1、P170 等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。二、在临床细胞免疫中的作用FCM 提供了一种简捷地监测细胞亚群的方法。即通过荧光抗原和抗体检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原(CD 分子)、细胞分类和各亚群进行分析，并计算出淋巴细胞各亚群的百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植的监测上起着重要的指导作用。如正常人群淋巴细胞 CD3+CD
7、4+/CD3+CD8+比值大约为 21，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用 FCM 还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应，如果 CD3+CD4+/CD3+CD8+比例倒置，病人预后良好，较少发生肾排异现象；反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于爱滋病的诊断和治疗中。白细胞表面分化抗原的检测：CD3+：T 淋巴细胞；CD45RA：未受刺激（Naive）T 淋巴细胞；CD45RO：记忆 T 淋巴细胞CD3-CD19+：B 淋巴细胞CD3-CD16+56+：NK 细胞【NK 细胞表达众多表面分子，如CD56、CD16、CD57、CD161 等，但这些表面标志都不是 NK 细胞所特有的，只具
8、有相对特异性。通常将CD56+、CD16+、CD3-、TCR-、BCR-的淋巴样细胞认为是 NK 细胞。以 CD56+CD16+，CD56+CD16-和 CD56-CD16+为标志将 NK 细胞分为 3 个亚群，发现 CD56 是 NK 细胞分化的特异性标志，而 CD16 的表达量与 NK 细胞的杀伤活性密切相关。在上述研究基础上许多学者主张以 CD56 的表达密度不同，将 NK 细胞分为 CD56bright 和CD56dim 两群.CD56brightNK 细胞高表达 CD56,低表达 CD16,KIR(killer cellimmunoglobulin-like receptors,KI
9、R)；表达高亲和力的 IL-2 受体。而 CD56dimNK 细胞高表达 CD16，低表达 CD56，仅表达中亲和力的 IL-2受体。CD56brightNK 细胞在 IL-2的作用下表现出较强的增殖作用，而CD56dim NK 细胞几乎不分泌细胞因子，且 IL-2不能促其增殖。CD56dim NK 细胞表现出较强的杀伤活性，而 CD56bright NK 细胞杀伤活性较低且表达一些末成熟标志，可以认为CD56bright NK细胞是未成熟的 NK 细胞，而 CD56dim 及 NK 细胞则相对较成熟，即 NK 细胞发育可能经历 CD56bright NK 细胞到 CD56dim NK 细胞这
10、样一个过程。】CD64：单核、巨噬细胞CD1a、CD83：树突状细胞CD3+CD4+CD8-：T 辅助/诱导淋巴细胞标记（Th/Ti）；CD3+CD4+CD29+：T辅助淋巴细胞诱导亚群标记，辅助 B 淋巴细胞产生抗体和诱导细胞介导的淋巴细胞溶解作用；CD3+CD4+CD45RA+：T 抑制淋巴细胞诱导亚群，诱导 Th 的活化和辅助其功能。T 辅助细胞还可分成 Th1、Th2 两个亚群，同时标记细胞内细胞因子 IFN-和 IL-4，可区分 Th1 细胞（CD4+/IFN-+）和 Th2 细胞（CD4+/IL-4+）。CD3+CD4-CD8+：T 抑制/杀伤淋巴细胞标记（Ts/Tc）；CD3+C
11、D8+CD28-：抑制性 T 淋巴细胞；CD3+CD8+CD28+：细胞毒 T 淋巴细胞；CD3/HLA-DR：同时计数外周血静止 T 淋巴细胞（CD3+HLA-DR-）、B 淋巴细胞（CD3-HLA-DR-）及活化 T 淋巴细胞（CD3+HLA-DR+）；CD25：白细胞介素 2低亲和力受体，其中 CD3+CD25+为活化 T 淋巴细胞，CD3+CD25-为静止 T 淋巴细胞；CD34、CD38、CD117、HLA-DR：造血干、祖细胞CD59：PNH 疾病监测；CD23：IgE 低亲合力受体，变态反应病、自身免疫、白血病和肾病综合症等病人 PBL 中 CD23 表达显著增加，阳性率与疾病严
12、重程度正相关；CD44：肿瘤患者 CD44 粘附分子与恶性度相关；目前 FCM 用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种，可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。三、在血液病诊断和治疗中的应用FCM 通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和 DNA 的检测分析，对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。1、白血病的诊断和治疗形态学分型是白血病分型的基础，而白血病免疫分型则是形态学分型的重要补充和进一步深化。形态学分型是基于细胞水平的观察，属于直观判断，其准确度与检测者的水平及主观因素有关。由于白血病细胞的异质性及分化程度不同，使细胞形态学表现不典型，细胞发育幼稚，再加上混合细胞性
13、白血病等，大约有20%30%病例难以明确诊断和分型。而应用 FCM 白血病免疫表型分析能够客观地、快速地分析异常细胞系来源及其分化阶段，大大地提高了白血病分型的准确性。常用的检测和鉴别白血病各系列的特异性标志为：T 淋巴细胞白血病：胞浆抗原CD3、抗 T 细胞受体(TCR)、抗 TCR、CD2、CD5、CD8、CD10 和 CD7B 淋巴细胞白血病：cCD79a、CD22、CD19、CD10、和 CD20+髓系白血病：抗髓性过氧化物酶(cMPO)、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和 CD64NK 淋巴细胞白血病：CD16、CD56 和 CD57红白血病：血型糖蛋白 A(Gly
14、 A)和 CD36巨核细胞白血病：CD41、CD42 和 CD61;其中，cCD79a 最具特异性，cMPO是髓系特异标志，cCD3 和 cCD79a 分别表达于早期 T 细胞和 B 细胞。另外，常用的白血病系列非特异标志为：CD34 和主要组织相容性抗原DR(HLA-DR）。，利用 FCM 可以测定出血细胞表达各种抗原的水平，协助临床确诊。同其它肿瘤的治疗一样，测定 DNA 倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。目前临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和
15、一些疑难性疾病。FCM 通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM 测定 CD34、HLA-DR、CD33 等细胞表面标志物，成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM 检测一系列指标观察病人的恢复状态，可以对预后做出早期的判断。2、其它种类血液病的诊断和治疗监测阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病，细胞 CD55、CD59 抗原表达减低是该病的一个特点。该抗原属于血细胞表面磷
16、脂酰肌醇锚连蛋白家族，是重要的补体调节蛋白，它通过与补体C8、C9 的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成，从而抑制细胞被补体激活溶解。FCM 采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞 CD59 的表达做定量分析，可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度。3、网织红细胞的测定及临床应用网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标，FCM 通过某些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)与红细胞中 RNA 结合，定量测定网织红细胞中RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。此外 FCM 还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义。为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制
17、状况等提供了依据。4、在血栓与出血性疾病中的应用(1)血小板功能的测定：正常情况下血小板以分散状态在血管内运行，但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变，FCM 可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白b/a,CD62，CD63 等)监测血小板功能及活化情况，有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化，借助于钙离子敏感荧光探针的帮助，用 FCM 测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。(2)血小板相关抗体的
18、测定：免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体，结合在血小板表面，称为血小板相关抗体，其分子可以是 IgG、IgA或 IgM，用羊抗人 IgG、IgA、IgM 荧光抗体标记被测血小板，FCM 可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体，间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。四、其他临床应用FCM 在自身抗体(HLA-B27)检测中的应用HLA 抗原是人类主要组织相容性复合体的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫应答、调节免疫应答的功能。根据 HLA 抗原结构、功能与组织分布的不同，可分为三
19、类;I、II、类分子。HLA-B27 基因属于类 MHC 基因，在淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，有人发现 HLA-B27抗原的表达与强直性脊柱炎有高度相关性。超过 90%的强直性脊椎炎患者其 HLLA-B27抗原表达阳性，普通人群中仅 5%10%为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此，HLA-B27 的检测在病情的诊断中有着重要意义。用流式细胞术检测 HLA-B27 的表达，无须分离淋巴细胞，操作简便、快速、自动化程度高、灵敏度可达 100，特异性达 97.4%。FCM 在人类同种异体器官移植期中的应用HLA 是人类主要相容性复合物(MHC)与器官移植排斥
20、密切相关。HLA 可分为三类抗原，即 I 类、II 类与 III 类，在这些抗原中，已肯定 I 类和 II 类抗原与移植有关。器官移植和骨髓移植成功的一个极其重要的因素是受、供体的组织配型，即移植前供受体的 HLA 分型对选择相合的供、受体十分重要。又由于移植后，移植物排斥移植物抗宿主病和原发病的复发等直接影响着患者和移植物的存活期。流式细胞术为移植前后提供了一个较传统方法更灵敏、快速，可鉴别针对亚群细胞的抗体和抗原的类型(1gG 或 1g M)，它不仅能在移植前发现高风险的受者，而且能监测移植间受者的免疫状态，预报移植物排斥。FCM 在细胞因子研究中的应用细胞因子是可溶性蛋白，可以调节细胞生长，分化，并且介导正常与病理性免疫应答。细胞因子是具有效应及调节双重作用的独特蛋白，作用于多细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标。流式细胞技术检测细胞因子其特点是在单细胞水平上进行测定，可在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子。该方法特异性强、敏感性高，可直接用于 Thl/Th2分析及其他细胞因子的检测。