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1、微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界 原生生物界真菌界病毒界微生物基础知识微生物基础知识第1页/共62页 了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：三、技能目标：第2页/共62页一、基础知识：（一）培养基 培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖
2、使用的混合营养液。（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途第3页/共62页培养基的种类培养基的种类液体培养基半固体培养基固体培养基据物理性质分天然培养基合成培养基据化学成分分选择培养基鉴别培养基据用途分常用于工业生产常用于观察微生物的运动、鉴定菌种用于微生物的分离、计数常用于工业生产常用于分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。例如，在培养基中加入青霉素，以抑
3、制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长。根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。第4页/共62页固体培养基：菌落第5页/共62页液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长第6页/共62页半固体培养基：无动力 有动力(弥散)(是否运动)第7页/共62页2、培养基配制原则：（1）目的要明确：根据微生
4、物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；真菌pH为：5.0-6.0。第8页/共62页3、培养基的营养构成、培养基的营养构成不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、和、和氮源氮源、无机盐无机盐等营养物质，另外等营养物质，另外还需要满足微生物生长对还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质特殊营养物质,例如例如:生长因子生长因子(即细菌生长必需，即细菌生长必需，而自身不能合成的
5、化合物而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、以及氧气、二氧二氧化碳化碳、渗透压等渗透压等的要求。的要求。第9页/共62页4、微生物的五种营养要素碳源（carbon source）氮源（nitrogen source）生长因子（growth factor）无机盐（mineral salts）水（wahtor）Cncnc-micro第10页/共62页 凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质都称为碳源。Cncnc-micro碳源第11页/共62页C素构成细胞及代谢产物的骨架素构成细胞及代谢产物的骨架C素是大多数微生物代谢所需的能量来
6、源素是大多数微生物代谢所需的能量来源自养微生物以二氧化碳或碳酸盐为惟一碳源进行代谢生长；异养微生物必须自养微生物以二氧化碳或碳酸盐为惟一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物作为碳源进行代谢生长。以有机物作为碳源进行代谢生长。碳源是异养微生物的主要能源物质。碳源是异养微生物的主要能源物质。碳源功能第12页/共62页无机无机C源：源：CO2、碳酸盐，只能被自养微生物利用、碳酸盐，只能被自养微生物利用有机有机C源：各种糖类，其次是有机酸、醇类、源：各种糖类，其次是有机酸、醇类、脂类和烃类化合物脂类和烃类化合物碳源种类Cncnc-micro第13页/共62页 凡凡是是能能为为微微生生物物提提供供所
7、所需需氮氮元元素素的的营营养养物质都称为氮源。物质都称为氮源。氮源(nitrogin source)Cncnc-micro第14页/共62页 为微生物提供合成细胞物质代谢产物的原料为微生物提供合成细胞物质代谢产物的原料对许多微生物来说，既可利用无机态氮，也对许多微生物来说，既可利用无机态氮，也可利用有机态氮。可利用有机态氮。固氮微生物可以利用氮气作为氮源进行生长。固氮微生物可以利用氮气作为氮源进行生长。某些种类的氮源也能为微生物提供能量，如某些种类的氮源也能为微生物提供能量，如NH3既是硝化细菌的氮源又是能源，含既是硝化细菌的氮源又是能源，含C、H、O、N的蛋白质等也能为微生物提供能量。的蛋白
8、质等也能为微生物提供能量。氮源功能Cncnc-micro第15页/共62页分子态氮：固氮微生物以分子氮为唯一氮源分子态氮：固氮微生物以分子氮为唯一氮源无机态氮：硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用无机态氮：硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用有机态氮：蛋白质及其降解产物有机态氮：蛋白质及其降解产物a实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源氮源b生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等等氮源种类Cncnc-micro第16页/共62页 构成微生物细胞的组成成分构成微生物细胞的组成成分调解微生物细胞的渗透压，调解微生物细胞的渗透压，PH值和氧化
9、还原电值和氧化还原电位位有些无机盐如有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生物的能源还可做为自养微生物的能源构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。Mg、Ca、K是多种酶的激活剂是多种酶的激活剂无机盐（mineral salts）无机盐功能Cncnc-micro第17页/共62页 构构成成微微生生物物细细胞胞以以C、H、O、N、P、S六六种元素为主，约占细胞干重的种元素为主，约占细胞干重的95以上；以上；Ca、K、Mg、Fe为为大大量量元元素素，以以无无机机盐盐阳阳离离子子形形式式被被吸吸收收，配配培培养养基基要要加加磷磷酸酸盐盐、硫酸盐。硫酸盐。Zn、Ca、Mn、
10、Co、Mo等等微微量量元元素素，在在微微生生物物培培养养中中有有0.1PPM就就可可以以了了，自自来来水水原料中已够用，不需另加。原料中已够用，不需另加。无机盐种类Cncnc-micro第18页/共62页 微生物生长不可缺少的微生物生长不可缺少的微量有机物质叫生长因子。微量有机物质叫生长因子。维生素 氨基酸碱 基 Cncnc-micro生长因子第19页/共62页 有的微生物自己不能合成维生素，需要外加，主要是有的微生物自己不能合成维生素，需要外加，主要是B族维生素、硫族维生素、硫胺素、叶酸、泛酸、核黄素等，如生产味精需加生物素（是胺素、叶酸、泛酸、核黄素等，如生产味精需加生物素（是B族中的一种
11、即族中的一种即VH）。）。维生素Cncnc-micro第20页/共62页 有有些些微微生生物物自自己己不不能能合合成成某某种种氨氨基基酸酸，必必须须给给予予补补充充，如如赖赖AA发发酵酵所所用用的的黄黄色色短短杆杆菌菌不不能能合合成成环环丝丝AA，为为环环丝丝AA缺缺陷陷型型菌菌株株，在在培培养养基基中中必必须添加含环丝须添加含环丝AA的氮源。如豆饼水解液或毛发水解液等。的氮源。如豆饼水解液或毛发水解液等。氨基酸Cncnc-micro第21页/共62页 嘧啶和嘌呤是核酸和辅酶的重要组分，是许多微生物必须的生长因素。嘧啶和嘌呤是核酸和辅酶的重要组分，是许多微生物必须的生长因素。有有些些微微生生物
12、物不不仅仅不不能能合合成成嘧嘧啶啶和和嘌嘌呤呤，而而且且不不能能将将补补充充的的嘧嘧啶啶和和嘌嘌呤呤结结合合在在核核苷苷酸酸上上，还还必必须须供供给给核核苷苷酸酸，有有的的菌菌需需补补充充卟卟啉啉或或其其衍衍生生物物，还还有有的的菌菌需供给（低碳）脂肪酸等。需供给（低碳）脂肪酸等。碱基Cncnc-micro第22页/共62页水Cncnc-micro 是细胞中生化反应的良好介质；营养物质和代谢产物都必须溶解在水里，是细胞中生化反应的良好介质；营养物质和代谢产物都必须溶解在水里，才能被吸收或排出体（细胞）外。才能被吸收或排出体（细胞）外。水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温
13、度水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温度骤然上升。骤然上升。维持细胞的膨压（控制细胞形态）。维持细胞的膨压（控制细胞形态）。第23页/共62页碳源、氮源、生长因子的比较碳源、氮源、生长因子的比较来 源常用原料功 能碳源CO2、NaHCO3、糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类构成细胞物质和一些代谢产物，有些还是异养做生物的主要能源物质氮源N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝酸盐等合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶、核酸等的组成成分第24页/共62页选择培养基选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食
14、盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞第25页/共62页 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:第26页/共62页 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受
15、限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;天然培养基：第27页/共62页（二）无菌技术1.无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。第28页/共62页（）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。2.消毒与灭菌的概念及两者的区别 第29页/共62页（2）灭菌的定义：是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括所有细菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒，
16、而达到完全无菌之过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。第30页/共62页比比较较项项理化因素的理化因素的作用强度作用强度消灭微生物消灭微生物的数量的数量芽孢和孢子芽孢和孢子能否被消灭能否被消灭消消毒毒较为温和较为温和部分生活状部分生活状态的微生物态的微生物不能不能灭灭菌菌强烈强烈全部微生物全部微生物能能消毒与灭菌的比较第31页/共62页1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法第32
17、页/共62页1、灼烧灭菌接种环、接种针、试管口2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.(2)灭菌的方法：第33页/共62页 最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。培养微生物的培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微
18、生物的污染而设计的。第34页/共62页1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。第35页/共62页3.微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存第36页/共62页三、实验操作（一.）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）第37页
19、/共62页1计算、称量2溶化3调pH：pH764过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞7包扎操作步骤第38页/共62页 8灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。9倒平板:待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10无菌检查：将灭菌的培养基放
20、入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。第39页/共62页倒平板技术倒平板技术第40页/共62页 1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第41页/共62页3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高
21、，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第42页/共62页（二）、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术第43页/共62页菌落：菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成
22、一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。第44页/共62页菌落细菌的菌落特征因种而异 第45页/共62页霉菌的菌落特征因种而异菌落第46页/共62页第47页/共62页 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线
23、时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第48页/共62页 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第49页/共62页第50页/共62页第51页/共62页 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步
24、应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。第52页/共62页微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养第53页/共62页四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原
25、因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。第54页/共62页微生物的恒温培养微生物的恒温培养第55页/共62页菌种的保存菌种的保存 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法第56页/共62页本课题知识小结:第57页/共62页【典例解析】例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮
26、源也能提供能量 解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D第58页/共62页例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确不正确的是A.防止杂菌污染
27、 B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前答案：B 解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是A正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。第59页/共62页编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2H
28、POHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 .自养型微生物 含碳有机物 第60页/共62页（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。（6）右表中各成分重量确定的原则是 。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。固氮微生物 3 调整pH 依微生物的生长需要确定 琼脂（或凝固剂）第61页/共62页感谢您的观看！第62页/共62页