《微生物的分类与鉴定学时.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物的分类与鉴定学时.pptx（82页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第一节 微生物的纯培养和显微技术一、微生物的分离二、微生物的保藏技术三、微生物的显微技术第1页/共82页一、微生物的分离一、微生物的分离（一）稀释平皿分离法（二）平皿划线分离法（三）稀释摇管法（四）单孢挑取法（五）选择性培养基分离法第2页/共82页微生物的纯培养自然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微生物混杂在一起的群体要研究微生物生长，首先必须把它从混杂的微生物类群中分离出来纯培养（pure culture）：微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代第3页/共82页（一）稀释平皿分离法稀释平皿分离法：将分离样品作一系列的稀释，使样品中微生物细胞充分分散，并培养于琼脂平皿上（内
2、）长出微生物菌落的方法如果稀释度合适，就可出现分散的单菌落，它可能就是由一个微生物细胞或同源细胞组成的微菌落繁殖形成的挑取该单菌落，便可得到纯培养第4页/共82页第5页/共82页一、微生物的分离一、微生物的分离（一）稀释平皿分离法（二）平皿划线分离法（三）稀释摇管法（四）单孢挑取法（五）选择性培养基分离法第6页/共82页（二）平皿划线分离法平皿划线分离法：倒置琼脂平皿，用无菌接种环挑取一定量的待分离材料，在培养基表面通过各种方式的划线而达到分离的目的这种方法是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到面”逐渐稀释，划到最后，常可以形成单菌落挑取该单菌落，便可得到纯培养第7页/共82页第8页/共
3、82页一、微生物的分离一、微生物的分离（一）稀释平皿分离法（二）平皿划线分离法（三）稀释摇管法（四）单孢挑取法（五）选择性培养基分离法第9页/共82页（三）稀释摇管法稀释摇管法：对氧气敏感的厌氧性微生物所采用的分离方法；将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后，冷却并保持在50左右，用这些试管进行梯度稀释待分离材料，试管均匀，冷凝，倾注一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开培养后，菌落形成在琼脂柱的中间，挑取和移植单菌落第10页/共82页第11页/共82页一、微生物的分离一、微生物的分离（一）稀释平皿分离法（二）平皿划线分离法（三）稀释摇管法（四）单孢挑取法（五）选择性培
4、养基分离法第12页/共82页（四）单孢挑取法单孢挑取法：首先对样品进行充分稀释，用单孢操作器在解剖显微镜下将一个单独的细胞或孢子直接挑选而出，接种在培养基上培养，使之形成单菌落此法常用于真菌单孢子的分离，需要熟练的技术第13页/共82页第14页/共82页一、微生物的分离一、微生物的分离（一）稀释平皿分离法（二）平皿划线分离法（三）稀释摇管法（四）单孢挑取法（五）选择性培养基分离法第15页/共82页（五）选择性培养基分离法选择性培养基分离法：采用适宜的选择性培养基能自微生物混杂的基质内分离和鉴定某种微生物的方法不同微生物对营养物质和环境因素的要求不同：如在不含氮素的Ashby培养基可用于筛选固氮
5、细菌不同微生物对不同的化学试剂如消毒剂、染料、抗生素等具有不同程度的抵抗能力：如加入青霉素的培养基能抑制大多数革兰氏阳性细菌的生长第16页/共82页第17页/共82页二、微生物的保藏技术二、微生物的保藏技术（一）菌种保藏的目的与原理（二）菌种的保藏方法第18页/共82页（一）菌种保藏的目的与原理菌种保藏：就是根据微生物菌种特性及保藏目的的不同，给菌种以特定的条件，使其存活而得以延续目的：收集各种研究、教学和生产性菌种；高质量保藏；可提供交换和使用基本原理：将菌种保存于不良环境中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养饥饿等而使其代谢速率极为缓慢或处于休眠状态；或将菌种不断在新鲜培养基上转接传代第19页
6、/共82页二、微生物的保藏技术二、微生物的保藏技术（一）菌种保藏的目的与原理（二）菌种的保藏方法第20页/共82页（二）菌种的保藏方法方法 原理 适宜菌种 保藏时间 特点 斜面冰箱保藏低温、传代各大类微生物 36 月 短期、简便 石蜡油封藏低温、缺氧 各大类微生物 12 年 简便、中期 砂土管保藏 干燥、无营养 产芽孢或产孢的微生物110 年 简便、中长期 冻干管保藏 干燥、无氧、无营养各大类微生物 515 年以上 繁琐、长期 第21页/共82页第22页/共82页第23页/共82页第24页/共82页第25页/共82页1、国内部分菌种保藏中心普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)：中科院微生物
7、所，北京(AS)，真菌、细菌；中科院武汉病毒研究所，武汉(AS-IV)，病毒工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：轻工业部食品发酵工业科学研究所，南京(ID)，真菌；卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)，细菌；中国医学科学院病毒研究所，北京(IV)，病毒第26页/共82页2、国外部分菌种保藏中心美国：典型菌种保藏中心（ATCC）；北部地区研究实验室（NRRL）英国：国家典型菌种保藏中心（NCTC）日本：大阪发酵研究所（IFO）第27页/共82页三、微生物的显微技术三、微生物的显微技术（一）显微镜的种类及原理（二）微生物的显微技术第28页/共82页（一）显微镜的种类及原理1、普通光学
8、显微镜2、暗视野显微镜3、相差显微镜4、荧光显微镜5、透射电子显微镜6、扫描电子显微镜第29页/共82页第30页/共82页三、微生物的显微技术三、微生物的显微技术（一）显微镜的种类及原理（二）微生物的显微技术第31页/共82页（二）微生物的显微技术1、活体观察2、染色观察第32页/共82页1、活体观察活体观察：可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片法等在明视野、暗视野或相差显微镜下对微生物活体进行直接观察应用：可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性及生长过程中的形态变化，如细胞分裂、芽孢萌发等动态过程优点：可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏第33页/共82页第34页/共82页2、
9、染色观察染色观察：通过染色，将微生物细胞浸入染色剂内，使菌体细胞的某一部分染上与其他部分不同的颜色或深度不同的颜色，产生不同的折射率，以便观察 染色方法：革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色第35页/共82页第36页/共82页第一章 微生物的分类与鉴定（4学时）第 一 节 微 生 物 的 纯 培 养 和 显 微 技 术（2 学 时）第 二 节 微 生 物 的 分 类 与 鉴 定（2 学 时）第37页/共82页第二节 微生物的分类与鉴定一、微生物的分类二、微生物的鉴定第38页/共82页分类、鉴定与命名分类（classification）：根据各种生物的相似性和进化关系将其分为类群，排放在适当的分类单元
10、中鉴定（identification）：是分类的操作过程，经过一系列测定来确定所研究的菌株属于哪个类群命名（nomenclature）：根据命名的国际法规对所鉴定的菌株给以科学名称（学名）第39页/共82页一、微生物的分类一、微生物的分类（一）微生物的分类单元（二）微生物的命名（三）微生物的分类方法（四）微生物的分类系统第40页/共82页（一）微生物的分类单元 界 Kingdom 门 Phylum 纲 Class 目 Order 科 Family 属 Genus 种 Species -亚种 subspecies，subsp.变型 variety，var.第41页/共82页1、种的概念种（spe
11、cies）：微生物分类的基本单位；是指以某个“标准菌株”为代表的具有高度特征相似性的菌株群菌株（strain）：是单个微生物细胞在人工培养基上繁殖而来的纯培养物；它是微生物分类和研究工作中最基本的操作实体分离物（isolate）：是指已分离到但尚未鉴定的纯培养物第42页/共82页2、变型的概念变型（variety，var.）：是指微生物种以下，用某些特殊的特征加以区别的类群血清变型（serovar）：表示抗原结构不同生物变型（biovar）：表示特殊的生化或生理特征致病变型（pathovar）：表示某专一致病性噬菌体变型（phagovar）：表示对噬菌体的特异性反应形态变型（morphovar
12、）：表示特殊的形态特征第43页/共82页一、微生物的分类一、微生物的分类（一）微生物的分类单元（二）微生物的命名（三）微生物的分类方法（四）微生物的分类系统第44页/共82页1、双名法 依照国际命名法则，采用瑞典科学家林奈（Carl von Linne）在1753年提出的双名法：例1.金黄色葡萄球菌 Streptococcus aureus Rosenhach 1884例2.枯草芽孢杆菌 Bacillu subtilis（Ehrenberg）Cohn 1872（二）微生物的命名斜体字正体字（一般省略）学名=属名+种加词+（首次定名人）+现名定名人+现名定名年份第45页/共82页2、三名法学名=
13、属名+种加词+符号subsp.或var.+亚种或变种加词斜体字正体字（一般省略）斜体字例1.苏云金芽孢杆菌腊螟亚种 Bacillus thuringiensis subsp.galleria例2.丁香假单胞烟草致病变种 Pseudomonas syringae pv.tabaci第46页/共82页一、微生物的分类一、微生物的分类（一）微生物的分类单元（二）微生物的命名（三）微生物的分类方法（四）微生物的分类系统第47页/共82页（三）微生物的分类方法1、经典分类法2、化学分类法3、数值分类法4、分子遗传学分类法第48页/共82页1、经典分类法经典分类法（classic taxonomy）：最常
14、用的微生物分类方法，以形态学特征、生理生化特征、生态学特征等为依据，对微生物进行分类科以上的分类以形态结构特征为主，而科以下则以其生理生化特性和生态学特征为主第49页/共82页2、化学分类法化学分类法（chemotaxonomy）：根据微生物细胞结构或其代谢产物的化学组分分析结果，对微生物进行分类的方法，可作为微生物分类的辅助手段分析方法：血清学检测、气相或液相色谱分析、质谱分析、凝胶电泳等第50页/共82页3、数值分类法数值分类法（numerical taxonomy）：根据被鉴定的微生物与某类群之间的相似性而进行归类程序：选择菌株和待测性状 性状编码（为1，为0）菌株间相似性计算 聚类分析
15、（大于85%为同种，大于65%为同属）树状图或矩形图第51页/共82页4、分子遗传学分类法分子遗传学分类法：根据遗传学指标（即遗传机制和生物大分子，如DNA、蛋白质等的组成）对微生物进行分类项目：DNA的G+Cmol%分析、DNA-DNA杂交、DNA-rRNA杂交、16srRNA或18srRNA碱基序列分析等第52页/共82页一、微生物的分类一、微生物的分类（一）微生物的分类单元（二）微生物的命名（三）微生物的分类方法（四）微生物的分类系统第53页/共82页（四）微生物的分类系统惠特克（Whittaker,1969）五界系统：动物界，植物界，原生生物界，真菌界，原核生物界 沃斯（Woese，1
16、978）三域六界系统：古细菌域，仅有古细菌界；真细菌域，仅有真细菌界；真核生物域，包括原生生物界、真菌界、植物界和动物界第54页/共82页动物界植物界二界系统 1753年，瑞典学者Carolus Linnaeus：根据是具运动性和吞食性还是行固着生活和自养，提出把生物分为动物界(Animalis)和植物界(Plantas)第55页/共82页动物界 植物界原生生物界三界系统 1860年，德国动物学家Haeckel：建议在动物界和植物界之外，增加一个由低等生物构成的第三界-原生生物界(Protista)，包括菌类、低等藻类、原生动物等 第56页/共82页四界系统动物界 植物界原生生物界原核生物界1
17、956年，Copeland：动物界、植物界、原生生物界（包括原生动物、真菌、部分藻类）和原核生物界(Prokaryota)（包括细菌和蓝细菌）第57页/共82页1969年，Whittaker：根据营养方式的不同，认为应将真菌独立出，而把生物重新划分为动物界、植物界、原生生物界、真菌界(Fungi)和原核生物界五界系统1977年，中国学者陈世骧：建议在五界系统的基础上，将病毒(Virus)和类病毒(Viroids)另立为病毒界，从而形成了六界系统病毒界动物界植物界真菌界原核生物界原生生物界第58页/共82页三域学说 1978年，美国 C.R.Woese等：对生物进行16S和 18SrRNA的碱基
18、测 序并比较其同源性，提出了三域六界系统,即古细菌域(Archaebacteria),仅有古细菌界；真细菌域(Eubacteria),仅有真细菌界;真核生物域(Eucaryotes)，包括原生生物界、真菌界、植物界和动物界真细菌域古细菌域真核生物域三域六界系统第59页/共82页八界系统1989年，Cavalier Smith：提出了八界系统,即古细菌界、真细菌界、古真核生物界、原生动物界、藻界(Chromista)、植物界、真菌界和动物界 真细菌界植物界真菌界动物界古细菌界原生动物界藻界古真核生物界第60页/共82页二、微生物的鉴定二、微生物的鉴定（一）形态学特征测定（二）生理生化特征测定（三
19、）血清学试验（四）核酸的碱基序列分析（五）蛋白质的氨基酸序列分析第61页/共82页（一）形态学特征测定细胞的形态与结构：细胞的形态、大小与排列方式，细胞的结构与染色反应等培养性状：菌落形态、斜面菌苔特征、液体培养特征等第62页/共82页第63页/共82页第64页/共82页二、微生物的鉴定二、微生物的鉴定（一）形态学特征测定（二）生理生化特征测定（三）血清学试验（四）核酸的碱基序列分析（五）蛋白质的氨基酸序列分析第65页/共82页（二）生理生化特征测定营养类型：光合自养、光合异养、化能自养和化能异养等生态学条件：温度生长测定、好氧性测定、最适pH值测定、耐盐性测定等对碳源的利用：各种单糖、双糖、
20、多糖以及醇类、有机酸等对氮源的利用：蛋白胨、氨基酸、含氮无机盐、N2等对生长因子的需要：维生素、氨基酸等对抑菌剂的敏感性：抗生素、消毒剂、防腐剂等第66页/共82页大肠杆菌的几项生理生化测定结果第67页/共82页API细菌数值鉴定系统第68页/共82页二、微生物的鉴定二、微生物的鉴定（一）形态学特征测定（二）生理生化特征测定（三）血清学试验（四）核酸的碱基序列分析（五）蛋白质的氨基酸序列分析第69页/共82页（三）血清学试验抗血清的制备：微生物细胞或代谢产物注射小白鼠或家兔，采血后制备成抗血清凝聚试验：制备待检菌的菌悬液；取1滴于洁净的玻片上，加入抗血清混合，10s内观察菌体的凝聚现象第70页
21、/共82页二、微生物的鉴定（一）形态学特征测定（二）生理生化特征测定（三）血清学试验（四）核酸的碱基序列分析（五）蛋白质的氨基酸序列分析第71页/共82页（四）核酸的碱基序列分析1、G+C百分比的测定2、核酸杂交3、16SrRNA碱基测序第72页/共82页1、G+C百分比的测定测定方法：G+C含量越高，双链结合牢固，Tm越高；热变性温度（Tm）是指紫外吸收(OD260)增加的中点值所对应的温度应用：同属不同种G+C含量差别应低于10-15%，同种不同菌株G+C含量差别应低于4-5%第73页/共82页2、核酸杂交基本原理：不同菌种的同源序列之间互补结合形成杂合双链；杂交率越高，其亲缘关系就越近具
22、体方法：DNA-DNA杂交，DNA-rRNA杂交，核酸探针应用：杂交同源性在2060%是同属不同种，在60%以上为同一个种，超过70%为同一个亚种第74页/共82页3、16SrRNA碱基测序测定方法：测定16SrRNA（原核）或18SrRNA（真核）的序列，分析比较不同菌株间的同源性应用：若差别大于3%，就应考虑是新种；若差别大于5%-7%，就应考虑是新属构建系统发育树：以rRNA作为进化指征，用来概括各种（类）生物之间的亲缘关系的一种树状分枝的图形第75页/共82页第76页/共82页第77页/共82页二、微生物的鉴定二、微生物的鉴定（一）形态学特征测定（二）生理生化特征测定（三）血清学试验（四）核酸的碱基测序与分子杂交（五）蛋白质的氨基酸序列分析第78页/共82页（五）蛋白质的氨基酸序列分析氨基酸测序：蛋白质的氨基酸序列直接反映mRNA顺序，同源蛋白质氨基酸序列相似性越高，其亲缘关系越近肽指纹图谱测定：蛋白质的肽质量指纹图谱可以作为种以下分类和鉴定的依据第79页/共82页MALDI-TOF肽质量指纹图谱 第80页/共82页【小结】名词解释：种、菌株、分离物、变型、三域系统微生物分类方法有哪些，各种方法的主要依据是什么？介绍微生物保藏的基本原理及常用的菌种保藏方法？第81页/共82页感谢您的观看！第82页/共82页