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1、微生物学基础5单元五 微生物菌种的选育与保藏电子课件单元五 微生物菌种的选育与保藏学习目标学习目标学习目标学习目标1.1.了解了解微生物遗传变异的基础知识。微生物遗传变异的基础知识。2.2.理解理解微生物菌种选育的方法与机制。微生物菌种选育的方法与机制。3.3.理解微生物菌种衰退的理解微生物菌种衰退的原因原因、菌种菌种保藏的保藏的原理原理。4.4.掌握掌握菌种保藏与菌种复壮菌种保藏与菌种复壮的方法的方法。项目一项目一 微生物菌种的选育微生物菌种的选育主要内容主要内容一、微生物的一、微生物的遗传变异异二、从自然界分离二、从自然界分离筛选菌种菌种三、三、诱变育种育种项目一项目一 微生物菌种的选育微
2、生物菌种的选育菌菌种种是是从从事事微微生生物物学学及及生生命命科科学学研研究究的的基基本本材材料料，决决定定发发酵酵产产品的工业价值以及发酵工程成败的关键品的工业价值以及发酵工程成败的关键；n优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的；n微生物菌种的选育工作主要包括选种与育种两方面微生物菌种的选育工作主要包括选种与育种两方面；n选选种种，主主要要是是通通过过分分离离筛筛选选工工作作，从从中中挑挑选选符符合合生生产产要要求求菌菌种种的过程的过程；n育育种种，是是利利用用各各种种有有效效的的方方法法改改良良已已有有菌菌种种的的性性能能，以以达达到到
3、提提高产品质量或改良生产工艺的高产品质量或改良生产工艺的目的目的。n遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。n遗传：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代遗传：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息一套实现与其相同形状的遗传信息。特点。特点是具有稳定性，保证是具有稳定性，保证了种的存在和延续。了种的存在和延续。n变异：生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量变异：生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变，表现为子代之间、子代与亲代之间的差异。变异推发生改变，表现为子代之间、子代与亲代之
4、间的差异。变异推动了种的进化与发展动了种的进化与发展。一、微生物的遗传与变异（一）微生物遗传的物质基础三三个著名的实验，证实核酸是遗传变异的真正物质基础。个著名的实验，证实核酸是遗传变异的真正物质基础。n肺炎双球菌的转化实验肺炎双球菌的转化实验；n噬菌体的感染噬菌体的感染实验；实验；n烟草花叶病毒的重建实验烟草花叶病毒的重建实验。一、微生物的遗传与变异n核酸核酸:由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。nRNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，分mRNA、tRNA和rRNA。nDNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。
5、n遗传信息以核苷酸顺序的形式贮存在DNA分子中，它们以功能单位在染色体上占据一定的位置构成基因。一、微生物的遗传与变异（二）、微生物遗传物质的存在形式n核酸是生物体的遗传物质基础，细胞微生物主要存在于DNA中，非细胞微生物可存在于DNA或RNA中。n遗传物质在生物体的存在方式可从7个方面来加以叙述：l细胞水平l细胞核水平l染色体水平l核酸水平l基因水平l密码子水平l核苷酸水平一、微生物的遗传与变异（三）遗传信息的传递与表达n遗遗传传信信息息的的传传递递，是指亲代的遗传信息传递给子代的过程，即遗传物质的复制，一般是指DNA的复制。n生物的遗传物质是以半保留复制方式进行的，即每一个新复制的DNA双
6、链中，其中一条链来自于新代DNA，另一条链为与亲代DNA链互补的新链。这样，相应的遗传信息可以保留在亲代里，又可以完全地传递给子代，使亲代的表型性状在子代中得以完全表现。一、微生物的遗传与变异n遗遗传传信信息息的的表表达达，是指遗传信息行使功能的结果，一般是指DNA经过转录合成mRNA，然后翻译成为蛋白质，该蛋白质执行相应功能的结果。n遗传信息的表达一般遵循着中心法则，即：遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，完成遗传信息转录和翻译的过程。一、微生物的遗传与变异n转转录录，实际上是以DNA为模版合成mRNA的过程，是以基因片段为单位进行，可形成一条或多条同样的mRNA链，新合成
7、的mRNA链携带着与DNA编码链同样的遗传信息。n翻翻译译，是按照mRNA链上的遗传信息合成多肽链的过程。mRNA链上每连续的三个核苷酸组成一个三联体密码子，编码一种氨基酸。全套遗传密码共有64个密码子，共同编码20种氨基酸，除了少数氨基酸（如甲硫氨酸、色氨酸）外，一个氨基酸可有多个密码子。一、微生物的遗传与变异（四）遗传物质的变异变异，是指子代的表型特征与亲代有较明显的差异，其本质是遗传物质的改变，是由于基因突变或重组等因素引起。变异使遗传有了新的内容，使新的性状得以出现，促进了特种的演化。n野生型：野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株。n突变体突变体：发生了突变的微生
8、物细胞或菌株。一、微生物的遗传与变异1.1.基因突变基因突变n基因突变基因突变：基因组DNA分子发生的突然的、可稳定遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。n基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同时基因突变和DNA的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系。一、微生物的遗传与变异（1）基因突变的类型基因突变的类型n按按突变涉及范围突变涉及范围划分划分：n点突变：指基因序列或结构的改变，一般是指一对或少数几对碱基的改变；包括碱基转换和移码突变。n染色体畸变：指DNA分子中较大片
9、段的变化，包括数目畸变和结构畸变。一、微生物的遗传与变异n按按突变的表型突变的表型划分划分：l形态突变型：指引起细胞形态或菌落形态发生变化的那些突变。如菌落的大小、菌落产色的变化等。l致死突变型：由于突变造成细胞个体死亡。l条件致死突变型：由于突变使得菌株在某种条件下能正常生长繁殖，而在另一条件下表现为致死效应。l营养缺陷突变型：由于突变引起细胞某种酶的功能丧失，导致无法合成一种或几种生长因子，导致菌株无法在缺少该因子的培养基中正常生长繁殖。一、微生物的遗传与变异l抗性突变型：使得菌株具备抵抗有害理化因素的能力，可分为抗药性、抗紫外线性、抗噬菌体等突变类型。l抗原突变型：使得细胞表面成分发生变
10、化，导致细胞发生抗原性的变化。一、微生物的遗传与变异（2）基因突变的特点l不对应性：突变的性状与引起突变的原因之间无直接对应的关系。l自发性：突变可以在自然的条件下发生。l稀有性：突变率很低，一般在10-910-6之间。l独立性：基因突变是独立且随机发生的，一个基因的突变与另一个基因的突变之间是相互不关联的两个独立事件。l诱变性：通过诱变剂的作用可提高基因突变的频率，一般可以提高101105倍，但不改变突变的本质。l稳定性：基因突变化产生的新性状，可稳定地遗传给后代。l可逆性：基因突变可以是正向突变也可以是回复突变。一、微生物的遗传与变异2.2.基因重组基因重组n基因重组是指携带不同遗传信息的
11、DNA片段，通过重新组合形成新的基因组的过程。n通过基因重组所获得的子代具有不同于亲代的新基因组合，具有新的性状。n分为自然发生与人为操作两类。n在原核微生物中，主要有接合、转导、转化、原生质体融合等方式。n在真核微生物中，主要有有性杂交、准性生殖等方式。一、微生物的遗传与变异接接合合：是指两个原核细胞通过性菌毛直接接触，遗传物质从供体菌向受体菌转移，并产生基因重组的过程；转转导导：是以温和噬菌体为媒介进行的遗传物质重组的过程，是细菌遗传物质传递与交换的一种重要方式；转转化化：是细胞从周围介质中吸收异源DNA片段而使它的基因型及表型发生相应变化的现象。被吸收的DNA片段可以整合到自身染色体中，
12、也可以游离于其外（如质粒）。一、微生物的遗传与变异有有性性杂杂交交：是指不同遗传型的性细胞间发生接合，随之发生减数分裂与遗传重组，进而产生新遗传型子代的过程。能产生有性孢子的微生物（如酵母菌、霉菌、蕈菌等）都具有有性杂交的能力，可用此方法进行育种；准准性性生生殖殖：是指同种生物的两个不同株型的体细胞发生融合，不需要经过减数分裂就能进行基因重组从而产生新的性状的过程。主要包括异核体的形成、二倍体的形成、体细胞交换和单倍体化。一、微生物的遗传与变异二、从自然界分离筛选菌种n微生物广泛分布于自然环境中，而且它们常以各种形式混杂生长繁殖在同一环境中，因此在特定的环境下筛选微生物，可以得到人们所需要的菌
13、种。n从自然环境中分离筛选菌种的步骤主要包括：采样、增殖培养、纯种分离、初筛、复筛。菌种分离筛选菌种分离筛选流程流程图图二、从自然界分离筛选菌种（一）采样采样就是从自然界采集含有目标菌的样品。应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物。1.土壤采样n自然界众多环境中，土壤中微生物的种类及数量最多，土壤是采集样品的首选；n微生物的生理特性各不相同，受季节、表面植被、温度湿度、通风情况、光照、pH等因素的影响，因此采集土壤样品时应先进行详细的调查研究，设计可行的试验方案。二、从自然界分离筛选菌种2.2.根据微生物生理特性采样根据微生物生理特性采
14、样微生物的营养需要及代谢类型与其生长的环境有很大的相关性，特定的环境必然存在特定的微生物类群。n淀粉酶、糖化酶生产菌容易在面粉厂、酒厂、酱油厂等场所中分离得到；n蛋白酶、脂肪酶生产菌容易在肉类加工厂、奶制品厂、饭店污水污泥等场所中分离得到；n纤维素酶生产菌容易在腐烂草木的土壤中分离得到。二、从自然界分离筛选菌种（二）增殖培养n目的是让目标菌成为样品菌群中的优势菌，便于下一步的分离纯化获得纯种；n增殖培养主要根据微生物对营养素的需求、对生长繁殖条件因素的依赖来进行；n方法分两大类：控制培养基的营养成分、控制培养条件。二、从自然界分离筛选菌种1.1.控制培养基的营养控制培养基的营养成分成分n培养基
15、的营养成分主要指碳源、氮源、无机盐类、生长因子等；n控制增殖培养基中营养成分，结合目的微生物的最佳培养条件，使能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源而无法生长，从而达到增殖的目的。二、从自然界分离筛选菌种2.2.控制控制培养培养条件条件通过微生物对pH、温度及通气等条件的特殊要求来控制培养，得到所需的微生物菌种：npH值n培养温度和热处理n通风二、从自然界分离筛选菌种3.3.添加抑制剂添加抑制剂添加专一性抑制剂也可达到抑制不需增殖的微生物的目的，如：n土样悬浮液中加数滴10酚可抑制霉菌和细菌的生长，而放线菌仍生长；n添加青霉素、链霉素之类抗生素能抑制细菌的生长而真菌能正常生
16、长繁殖；n不同抗生素能抑制的菌类的范围不同，所用浓度等也不同，应区别分离对象、药物性质及适当的添加。二、从自然界分离筛选菌种（三）分离纯化n待分离的样品往往含有多种微生物，经过增殖培养可让目的菌成为优势菌，但富集后的培养物仍然是一个各类微生物的混合体；n为了获得某一特定微生物菌种，必须进行分离纯化，从已分离的单个菌落中选取目的菌；n采用平板反应快速检出法，根据目的菌特殊的生理特性设计有针对性的分离培养基，观察待分离菌在选择性培养基上的生长状况或生化反应，如透明圈、变色圈、抑菌圈、生长圈等进行筛选。二、从自然界分离筛选菌种1.1.透明圈法透明圈法n在平板培养基中加入唯一溶解性差的底物使培养呈浑浊
17、状态，能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，透明圈的大小初步反映该菌分解底物能力的强弱。n如筛选醋酸菌或乳酸菌时，往培养基中加入一定量的碳酸钙，透明圈越大则产酸能力越大。二、从自然界分离筛选菌种2.2.变色圈法变色圈法n对于一些不易用透明圈法筛选的菌，可在平板中加入指示剂或显色剂，菌落周围变色圈的大小初步反映该菌的这种特性的强弱。n如筛选产有机酸微生物时，往培养中加入溴麝香草酚蓝指示剂（pH7.6时呈蓝色），调节培养基pH使其呈蓝色，当菌落周围呈现黄色圈时，表明该菌能产有机酸，变色圈越大表示产酸能力越大。二、从自然界分离筛选菌种3.3.抑菌圈法抑菌圈法n是筛选抑菌物质（如抗生素）生产菌
18、常用的初筛方法。n如筛选分泌抗菌素的菌种时，挑取分离获得的单菌落接种至摇瓶培养基发酵一段时间，对发酵液进行初步处理，采用K-B法或打孔法进行抑菌圈大小的测量。n此方法中检测菌的选择十分重要，它直接关系到检出的灵敏度、筛选到的抗菌物质活性及抗菌谱。二、从自然界分离筛选菌种4.4.生长圈法生长圈法n此法通常用于分离筛选维生素、氨基酸、核苷酸等生长因子的产生菌，筛选的过程中会用到相对应的营养缺陷型菌株作为工具菌。n如筛选具有合成某种维生素的菌，将待检菌涂布于含有高浓度工具菌并缺少该维生素的平板上进行培养，若菌落周围形成一个浑浊的生长圈，说明该菌能合成此维生素，生长圈的大小反映了该菌合成此维生素能力的
19、大小。二、从自然界分离筛选菌种（四）菌种鉴定1.菌种筛选、菌种性能评价n在菌株分离的基础上，初筛就是进一步筛选目的产物生产能力高的菌株；n菌株的分离和初筛往往结合在一起进行；n筛选时初筛的淘汰率一般在90%左右，剩下的较好菌株要进行摇瓶复筛；n复筛的主要工作就是菌种性能测定，主要包括菌株的生产性能测定与毒性试验。二、从自然界分离筛选菌种2.2.菌种菌种的初步鉴定的初步鉴定n对筛选获得的菌株进行鉴定，尽可能地将其分类到种或属，以方便后续的科研与工业应用工作；n微生物菌种鉴定的方法一般有两种，一是生理生化鉴定，二是分子生物学鉴定；n随着基因库数据的不断完善，分子鉴定方法越显优势，其操作简单，结果可
20、靠，结合主要的生理生化鉴定试验，基本可以将菌株确定到种甚至是株型。二、从自然界分离筛选菌种n诱变育种是选择合适的诱变因素及剂量，人为地对出发菌株进行诱变处理，运用适合的筛选方法获得优良变异菌株的过程；n诱变育种是微生物菌种选育的主要方法，具有速度快、收效大、操作简单等优点。三、诱变育种（一）诱变育种的原理n微生物细胞经诱变剂处理后其遗传物质可发生两种类型的突变：点突变与染色体畸变，这两种类型的突变是导致菌株变异的主要原因；n诱变育种就是以人工诱变手段诱发生物体基因突变，从各变异体中筛选出目标变株；n与自然选育比较，诱变育种加以诱变剂处理，加速遗传物质突变的频率，扩大了变异的幅度，从而提高了获得
21、优良特性的突变株的概率。三、诱变育种n诱变剂诱变剂n能够使DNA分子结构发生改变，提高生物体突变频率的物质称为诱变剂；n大多数诱变剂在诱发生物体发生突变的同时还造成生物细胞的大量死亡，因此诱变剂都是一些有毒有害物质，具有致癌致畸的特性；n诱变剂的分类，主要有三大类：物理诱变因子、化学诱变因子、生物诱变因子；n诱变剂的作用：一是提高突变的频率；二是扩大产量变异的幅度；三是使变异向正变或负变的方向移动。三、诱变育种（二）诱变育种的步骤和方法出发菌株 细胞（孢子）悬浮液 诱变处理 涂布培养皿 初筛 菌种保存 复筛 试验、应用生产适宜用中等剂量（致死率70%80%）甚至更低。三、诱变育种1.1.出发菌
22、株的出发菌株的选择选择n一般选择单倍体纯种为出发菌株。n采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株。n选择对诱变剂敏感的菌株。由于有些菌株在发生某一变异后，会提高对其它诱变因素的敏感性，故可考虑选择已发生其它变异的菌株为出发菌株。n多挑选一些已经发生诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，以获得高产菌株。三、诱变育种2.2.单孢子（或单细胞）悬液的单孢子（或单细胞）悬液的制制备备细胞的生理状态对诱变处理的结果会产生很大的影响，因此细胞悬液的制备应注意以下几点：n对细菌进行诱变处理时，应制备其对数生长期前中期的细胞；n对霉菌或放线菌进行诱变处理时，应制备其孢子悬液，稍加萌
23、发后的孢子可提高诱变效率；n细胞悬液应控制在合理浓度，真菌孢子或酵母菌细胞应在106 107个/mL，细菌细胞或放线菌孢子约为108个/mL。三、诱变育种3.3.诱变处理诱变处理n诱变处理的时候，需要确定适合的诱变剂量；n合适的剂量：既能扩大变异幅度又能促使变异移向正突变范围的剂量；n高剂量（致死率90%以上）引起的变异范围较大，适用于单位产量较低的菌株；n中等剂量（致死率70%80%）适用于生产的经过多次诱变选育的菌株；n低剂量处理能提高正突变率，有利于高产菌株的稳定。三、诱变育种4.4.突变株的筛选突变株的筛选常规的筛选方法有：随机筛选、抗性筛选、营养缺陷筛选等。n随机筛选是指经诱变处理后
24、，进行分离，从中筛选优良菌株。可采用显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法、抑菌圈法等。n抗性筛选法相对比较容易，只要有10-6的突变频率，突变株就较容易筛选出来。常用的有一次性筛选法、阶梯性筛选法等。n营养缺陷筛选是指经过诱变处理后，突变菌株须在培养基中加入相应营养素成分才能正常生长，从而获得目标菌株的方法。筛选过程一般要经过诱变、淘汰野生型、检出缺陷型、确定生长谱四个环节。三、诱变育种项目二 微生物菌种的保藏主要内容主要内容一、菌种的衰退一、菌种的衰退二、菌种的复壮二、菌种的复壮三、菌种的保藏三、菌种的保藏菌种的菌种的衰退衰退：主要是指在生产应用中，菌株经过多次转接传代或保藏之后，群体中某些
25、本来优良的生理性状、形态特征逐渐减退甚至完全丧失的现象。一、菌种的衰退（一）微生物菌种衰退的现象1.1.菌菌落落形形态态或或细细胞胞形形态态改改变变：菌落形态常表现为颜色改变、形状改变等，细胞形态常表现为细胞畸形、孢子形状改变等；2.2.生生长长速速度度减减缓缓：主要表现为细胞代时延长，且产芽孢（孢子）速度变慢、量变少；3.3.生生产产性性能能下下降降：主要表现为菌株发酵能力下降，代谢物产量减少；4.4.对对生生长长环环境境适适应应能能力力下下降降：主要表现为抗不良环境条件的能力下降一、菌种的衰退（二）微生物菌种衰退的原因n菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程；n菌种衰退的主
26、要原因是关键基因的负突变；n当发生突变的个体达到一定数量时，会导致群体性能发生变化，表型上便呈现为菌种衰退。n衰退衰退过程：过程：开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。一、菌种的衰退微生物菌种衰退微生物菌种衰退的的主要主要原因原因有：有：1.1.自然自然变异变异：自发突变的几率很低，一般为10-910-6，但其代时较短，随着传代次数的增多，发生基因突变的机率会有所增加；2.2.环境条件的环境条件的影响影响：环境条件对菌种衰退是有影响的，当菌种处于不良
27、环境时，会加速衰退。环境条件主要是指培养基成分、温度、湿度、pH、氧气量、射线等。同时，不适宜的保藏条件会加快菌种衰退的速度。3.3.杂杂菌污染：菌污染：若菌种保藏不善，污染了杂菌，或感染了噬菌体，则容易发生衰退。一、菌种的衰退（三）微生物菌种衰退的预防根据菌种衰退的原因，可制定相应的预防措施，主要有以下几方面：1.控制传代次数；2.创造良好的培养条件；3.利用不同类型的细胞进行接种传代；4.采用有效的菌种保藏方法；5.定期进行菌种选育。一、菌种的衰退由于菌种衰退是无法避免的，因此应做好相关工作，减少相应的损失。生产、科研等应做好以下三方面工作：菌种保藏菌种复壮菌种选育一、菌种的衰退二、菌种的
28、复壮n主要工作：主要工作：微生物菌种的纯种分离、菌株性能测定；n目的：是从菌种群体中获得未衰退的或产生正突变的个体；n狭义：是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；n广义：是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识地进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期使菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。菌种复壮的主要方法1.1.纯纯种种分分离离：有平板划线法、涂布法、倾注法等方法，从中挑选出生产性能良好的菌株，达到菌种复壮的目的；2.2.选选择择适适合合的的培培养养条条件件：可以通过改变
29、培养基配方、选择适合的培养条件，可使菌种复壮；3.3.淘淘汰汰衰衰退退个个体体：对有抗性的菌种进行抗性压力选择（如药物、温度等因素），淘汰已衰退的细胞个体，使保存下来的细胞能保持原有性状；4.4.宿主体内复壮宿主体内复壮：多用于寄生性微生物菌株。二、菌种的复壮n在生产当中，菌种管理都要求对菌种进行定期的分离纯化，也就是说分离筛选一般都是在退化之前就进行的一中常规工作，是防止菌种退化或者生产育种而采取的一中积极措施。n在出现发酵水平较高和较低的情况下，也会进行菌种的分离筛选。前者的目的是期望从发酵液中分离出高产菌株，而后者则是期望从可能已经退化的种子中分离出尚未退化的菌株。二、菌种的复壮n菌种保
30、藏是指保持微生物菌株的生活力、遗传性状的技术。n菌种保藏的目的主要在于保持菌种的活力、保持菌种原有典型性状。n菌种保藏的原理：根据微生物的生理、生化特点，选用优良的菌种，人工创造条件降低其代谢活动强度，抑制其生长、繁殖，使其接近休眠状态，达到保持菌种活力、长时间保藏的目的。n通常采用的方法为低温、缺氧、干燥。三、菌种保藏菌种保藏的一般要求n应采用适宜的保藏方法。n产芽孢或孢子的微生物应优先保藏其休眠体。n同一菌种应使用两种或以上的保藏方法，每种方法至少有两个备份。n定期检查菌种的保藏效果。n做好菌种保藏的相关记录。三、菌种保藏（一）菌种保藏常用方法1 1、冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法n将微生物
31、细胞与保护剂（如脱脂牛乳等）混合制成悬液，注入安瓿管中，在冷冻干燥机中进行低温减压干燥，待水升华后制成固体菌块（或菌粉），并在真空条件下进行熔封，最后置于低温冰箱中保藏；n适宜菌种:除了丝状微生物的菌丝体不适宜于本法外，其它大多数微生物均可采用此法进行菌种保藏；n保藏期：一般为5 15年。三、菌种保藏2 2、液氮保藏法液氮保藏法n此法需要使用保护剂，常用的有甘油、二甲基亚砜等，其终浓度为10%30%；n适宜菌种：各类微生物；n保藏期：超过10年；n进行保藏操作时，将菌种与保护剂一起制备成浓度大于108个/mL的菌悬液或孢子悬液，分装于冻存管中，置于冰水浴中降温到0左右，然后使用程序降温仪以12
32、/min的速度降温至-35左右，迅速把冻存管置于液氮中保藏。三、菌种保藏3 3、斜面保藏斜面保藏法法n将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待生长完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。n此法是微生物菌种的短期保藏法，适合大多数微生物，如细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等。n放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。三、菌种保藏4、液体石蜡封存法液体石蜡封存法n将液体石蜡注入菌种斜面（或穿刺管）中，液面应高于斜面顶端至少1cm，加塞后垂直放置于4冰箱保藏。n液体石蜡具有隔绝空气
33、、防止水分挥发的作用，因此保藏期比斜面保藏法的效果好。n较适合好氧微生物的保藏，如酵母菌、霉菌可保藏2年以上，长者可达10年甚至更长。三、菌种保藏5、载体保藏法载体保藏法n使微生物吸附在适当的载体（土壤、砂土、滤纸等）上进行干燥保存的方法。n常用的有沙土保藏法，主要用于孢子的保存。n沙土经过处理后分装于安瓿管中，经灭菌、干燥，注入适量微生物细胞悬液并混匀，置于负压条件除去水分，密封保存。n此法简便，保存时间较长，微生物转接也较方便。三、菌种保藏6、寄主寄主保藏法保藏法n某些微生物（如病毒、立克次氏体、螺旋体和少数丝状真菌等）只能寄生在活的动物、植物或细菌中才能繁殖传代，故可针对寄主细胞或细胞的
34、特性进行保存。n如植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。n噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。n动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。三、菌种保藏（二）菌种保藏的注意事项1.1.保藏保藏方法的方法的选择选择：n微生物的种类很多，不同的微生物其特性可能差异很大，因此，应根据微生物菌种的具体特性、保藏的目的等因素来选择合适的保藏方法；n菌种经常使用，可选择斜面低温保藏法；n需长期保藏，可选择超低温保藏法或液氮保藏法。三、菌种保藏2.2.细胞菌龄的细胞菌龄的选择选择n对微生物菌种进行保藏时，不同菌龄的微生物细胞对保藏的效果有较大的影
35、响；n一般情况下，应选择生长同步且成熟的细胞群体、抗逆性强的孢子或芽孢进行菌种保藏；n保藏不产芽孢的细胞、酵母菌时，应选择对数生长期末期到稳定期初期之间的细胞；n保藏产芽孢细胞、放线菌、霉菌时，应选择其成熟的芽孢或孢子。三、菌种保藏3.3.细胞悬液细胞悬液n增大菌种的悬液浓度，可提高存活的细胞数量，提高菌种的存活机率。一般情况下，细菌细胞或芽孢的浓度应不低于108个/mL；酵母菌细胞或霉菌孢子的浓度应不低于107个/mL；n另外，微生物经过培养后，培养基中可能存在对细胞有害的代谢产物，因此，对使用液态培养基培养的微生物细胞可离心去除培养液，再用无菌水悬浮成菌悬液，斜面菌种则可直接用无菌水洗脱成
36、菌悬液。三、菌种保藏4.4.保护剂保护剂n保藏温度过低时，细胞内的自由水可形成冰晶，会对微生物菌种造成伤害，此时可加入保护剂，适合的保护剂可有效使细胞内的自由水渗出胞外，减少胞内冰晶的形成，有利于提高菌种的存活率，延长保藏期；n常用的保护剂一般有甘油、脱脂牛乳、山梨醇、葡聚糖、淀粉、血清等，使用终浓度一般为10%30%。三、菌种保藏5.5.冻结和解冻的冻结和解冻的速度速度n对于液氮保藏法，冻结速度和解冻速度对保藏的效果影响较大，一般使用慢冻结而快解冻的方式；n研究表明，速度在110/min范围内的程序降温，细胞死亡率低，超过10/min的快速冻结，细胞的死亡率大大提高（真核微生物较显著）；n解
37、冻时，一般迅速放置于3540的温水中快速解冻，接着进行菌种活化相关工作；如果解冻速度较慢，有可能出现细胞内再结冰，对细胞造成伤害，从而影响菌种保藏的效果。三、菌种保藏6.6.菌种活化菌种活化n菌种的活化就是将保藏状态的微生物菌种置于适宜的条件中培养，使其恢复原有生命活力及优良性状的过程；n活化菌种时，应使用该菌种的最适合培养基及培养条件，经过23代的转接培养，即可达到活化的目的；n一般情况下，斜面低温保藏的菌种转接一次即可，而超低温长时间保藏的菌种则需要转接23次。三、菌种保藏思考题1.名词解释：基因突变、诱变育种、营养缺陷型、转化、菌种衰退、菌种复壮、菌种活化。2.根据突变修复原理，紫外线诱变处理菌种时，应注意什么?如何保证细胞均匀受到诱变剂的处理？3.简述菌种筛选的过程。4.诱变育种的基本环节有哪些？关键是什么？为什么？5.试述基因突变特点、类型和规律。6.如何应用代谢调控原理筛选工业上的生产菌？举例说明。7.简述菌种保藏的原理，列举几种常用的方法。