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1、发酵工艺 项目二：菌种的选育与保藏电子课件项目二项目二 菌种选育与保藏菌种选育与保藏工业生产上常用的微生物有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类，由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步成为工业生产的微生物。对菌种有下列要求：原料廉价、生产迅速、目的产物产量高；易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短；抗杂菌和噬菌体的能力强；菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。一、工业生产常用的微生物一、工业生产常用的微生物工业微生物产生菌的筛选一般包括两部分：一是从自然界分离所需要的菌株；二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别
2、。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。二、重要工业微生物的分离筛选二、重要工业微生物的分离筛选（一）菌种标本的采集土壤是微生物的温床，土壤样品往往是首选的采集目标。采样时，将表层5cm左右的浮土除去，取525cm处的土样1025g，装入事先准备好的容器内，编号并做好记录。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。（二）样品的预处理为提高菌种分离的效果，在分离之前，对采集到的含微生物的样品要进行预处理含微生物的样品预处理方法含微生物的样品预处理方法材料处理方法具体措施分离菌株水、粪肥热处理55/6min嗜粪红球菌、小单孢菌属土壤、根土热处理100/1h或40/（26h）
3、链霉菌、马杜拉菌等土壤热处理80/10min芽孢杆菌海水、污泥离心法不同转速处理链霉菌属发霉稻草空气搅拌法在沉淀池中搅拌嗜热放线菌土壤化学法培养基中添加1%的几丁质链霉菌属土壤化学法培养基中添加碳酸钙提高pH链霉菌属土壤诱饵法花粉埋在土壤11周游动放线菌属土壤诱饵法用涂石蜡的棒置于碳源培养基中诺卡氏菌土壤诱饵法人头发埋在土壤里角质菌属（三）富集培养富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一定的限制性因素（如选择性培养基、特定培养条件、添加抑制剂或促进剂等），使目的微生物在最适的环境下迅速生长繁殖，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。1.控
4、制培养基的营养成分在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作唯一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。2.控制培养条件 在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其它一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效分离的目的。3.抑制不需要的杂菌通过高温、高压、添加抗生素等抑制其它微生物杂菌的生长。在选择性培养基中,也经常采用加入抗生素或抑制剂来增加其选择性 培养基中加入抗生素（抑制剂）及分离菌培养基中加入抗生素（抑制剂）及分离菌抗生素等浓度/（g/mL）受抑制菌欲分离菌放线菌
5、酮（50500），杀真菌素(100)霉菌、酵母菌一般细菌多粘菌素（5）G-细菌节杆菌放线菌酮（100）G+细菌G-细菌青霉素（1）G+细菌肠杆菌胆汁酸（15005000）大肠杆菌沙门氏菌制霉菌素（50），亚胺环己酮（50）真菌高温放线菌新生霉素（25），链霉素（0.52）细菌马杜拉放线菌稀释涂布法和划线分离法是微生物学中常见的两种分离方法1.利用平皿的生化反应进行快速分离（四）纯种分离（四）纯种分离微生物特异性平板检测微生物特异性平板检测项目和项目和方法方法（酶为胞外酶）（酶为胞外酶）项目检测方法柠檬酸pH指示颜色变化或掺入琼脂平板的碳酸钙的溶解淀粉酶由碘液指示的可溶性淀粉的液化蛋白酶酪蛋白的
6、溶解脂肪酶三丁酸甘油酯的消化，以维多利亚蓝为指示剂形成透明圈果胶酶果胶凝胶的液化（1.5%的聚果胶酸钠），多糖沉淀剂磷酸脂酶C卵磷脂平板的混浊圈 磷酸脂酶A卵磷脂平板的透明圈纤维素酶纤维素平板的透明圈酶抑制剂用含酶的琼脂平板上的抑制圈筛选平皿快速检测法有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等平皿快速检测法示意图 透明圈法和变色圈法以淀粉为碳源的培养基产生的变色圈酪蛋白培养基产生的透明圈抑菌圈法 牛津杯滴样得到的抑菌圈滤纸片法形成的抑菌圈示意图1-滤纸片；2-细菌生长区；3-抑菌区1.初筛 初筛是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。初筛可以分为两种情
7、况进行。（1）平板筛选（2）摇瓶发酵筛选（五）野生型菌株的筛选（五）野生型菌株的筛选2.复筛 一般通过摇瓶或台式发酵罐进行液体培养，再对培养液进行分析测定，才能逐步地筛选出高产菌株。摇瓶（发酵罐）复筛是经过初筛得到的较优良菌株进一步复证，考察其产量性状的稳定性，从中再淘汰一部分不稳定的、相对产量低的或某些遗传性状不良的菌株。复筛时，一个菌株通常要重复35个瓶。经典分类鉴定方法主要根据形态学特征、生理生化特征、血清学试验和噬菌体分型等 现代分类鉴定方法主要是利用分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作用，如，微生物遗传型鉴定（DNA碱基组成分析、DNA-D
8、NA杂交、16S rRNA同源性分析、以DNA为基础的分型方法等）另外，还有细胞化学成分特征分类法。（六）野生型菌株的鉴定（六）野生型菌株的鉴定（一）诱变育种利用物理、化学或生物制剂等因素，使微生物的遗传物质发生变异导致物种的遗传性状改变，从而获得生产上的优良菌株的方法统称诱变育种。诱变育种与其它育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。三、发酵工业菌种的改良三、发酵工业菌种的改良杂交育种的一般程序为：选择原始亲本诱变筛选直接亲本直接亲本之间亲和力鉴定杂交分离到基本培养基或选择性培养基筛选重组体重组体分析鉴定（二）杂交育种（二）杂交育种微生
9、物杂交的程序 原生质体融合的方法是先用酶酶解两个出发菌株的细胞壁，在高渗环境中释放出原生质，然后将它们混合，在助融剂或电场作用下，使它们互相凝集，最后发生细胞融合，实现遗传重组。一般包括原生质体制备，原生质体融合，原生质体再生和融合子筛选等步骤。（三）原生质体融合育种（三）原生质体融合育种 微生物原生质体融合的一般原理和过程微生物原生质体融合的一般原理和过程 原生质体制备时菌体去壁方法原生质体制备时菌体去壁方法微生物细胞壁主要成分去壁方法革兰氏阳性菌芽孢杆菌肽聚糖溶菌酶处理葡萄球菌肽聚糖溶葡萄球菌素处理链霉菌肽聚糖溶菌酶处理（菌丝生长时补充0.5%5.0%甘氨酸或10%34%的蔗糖）小单孢菌肽
10、聚糖溶菌酶处理（菌丝生长时补充0.2%0.5%甘氨酸）革兰氏阴性菌大肠杆菌肽聚糖和脂多糖溶菌酶和EDTA处理黄色短杆菌肽聚糖和脂多糖溶菌酶处理（生长时补充0.41M的蔗糖或0.3U/mL青霉素）霉菌纤维素和几丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌葡聚糖和几丁质蜗牛酶（四）基因工程育种（四）基因工程育种 基因工程生产胰岛素过程示意图基因工程生产胰岛素过程示意图 诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。四、诱变育种及其应用四、诱变育种及其应用 诱变育种一般步骤诱变育种一般步骤 几种化学诱变剂常用浓度及处理时间几种化学诱变剂常用浓度及处理时间诱变剂诱变剂浓度处理时间缓冲液终止反应方法
11、亚硝酸0.010.1mol/L510minpH4.51mol/L醋酸缓冲液pH8.6，0.07mol/L磷酸二氢钠溶液硫酸二乙酯（DES）0.51（体积分数）1030min，孢子1824hpH7.0磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释亚硝基胍（NTG）0.11.0 mol/mL，孢子3mg/mL1560min，孢子90120minpH7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液大量稀释氮芥0.11.0 mol/mL510min甘氨酸或大量稀释氯化锂0.30.5加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释秋水仙碱0.010.2加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释 诱变剂复合处理效果诱变剂复合处理效果
12、菌种单独处理复合处理诱变剂突变率/%诱变剂突变率/%土曲霉紫外线21.3紫外线+X射线42.8x射线19.7紫外线4.7链霉菌紫外线31.0紫外线+射线43.6射线35.0金色链霉菌（2U-84）二乙烯三胺6.06紫外线+二乙烯三胺26.6硫酸二乙酯1.78紫外线+硫酸二乙酯35.86紫外线12.5 灰色链霉菌(JIC-1)紫外线9.8紫外线+可见光照射1次紫外线+可见光照射6次9.716.6营养缺陷型突变菌株的筛选营养缺陷型：指野生型菌株因某些物理或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、核酸碱基、维生素)的能力，只能在补充了相应生长因子的培养基
13、上才能正常生长。基本培养基：仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的培养基。完全培养基：含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。完全培养基营养丰富，全面，一般可在基本培养基中加入富含氨基酸，维生素和碱基之类的天然物质配制而成。补充培养基：补充一种或数种生长因子，以满足某微生物特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加氨基酸、碱基或维生素而提供。营养缺陷型菌株筛选包括诱变处理、淘汰野生型（浓缩）、检出营养缺陷型、确定生长谱等步骤。1、淘汰野生型菌株方法 限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去。淘汰野
14、生型菌株（浓缩）的方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法等。抗生素法：某些抗生素能杀死生长繁殖的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成。菌丝过滤法：适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养1012h，使野生型长成菌丝体，然后以滤纸、棉花等介质过滤，菌丝被滤除，未萌发的缺陷型孢子能顺利通过，从而达到富集营养缺陷型的目的。差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点，先将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死营
15、养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发而得以存活。（2）检出缺陷型 浓缩后得到的营养缺陷型菌株比例较大，但不能保证全部为营养缺陷型菌株，还需要进一步分离。营养缺陷型菌株逐个检出法营养缺陷型菌株逐个检出法 营养缺陷型菌株影印检出法营养缺陷型菌株影印检出法（3）鉴定缺陷型a.酪素水解液（或氨基酸混合液），代表氨基酸类；b.水溶性维生素混合液，代表维生素类；c.核酸水解液（碱基），代表嘌呤、嘧啶类。（一）菌种保藏原理菌种保藏是根据菌种的生理生化特点，人为创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温等条件，抑制菌种繁殖能力，使其处于“休眠”状态。五、工业菌种的保藏五、工业菌种的保藏（二）菌种保藏方法（二）菌种保藏方法 几几种常用菌种保藏方法的比较种常用菌种保藏方法的比较方法主要措施适宜菌种保藏期冰箱保藏法（斜面）低温（4）各大类约16月冰箱保藏法（半固体）低温（4），避氧细菌、酵母菌约612月石蜡油封藏法低温（4），阻氧各大类约12年砂土保藏法干燥，无营养产孢子微生物约110年冷冻干燥保藏法干燥、低温、无氧，有保护剂各大类510年液氮保藏法超低温（196），有保护剂各大类15年 真空冷冻干燥保藏示意图真空冷冻干燥保藏示意图