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1、ICS 65.060.99CCS B 90T/ZNZ浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准T/ZNZ 1602023水产品中四种硝基呋喃类代谢物的快速检测 胶体金免疫层析法Rapid detection of four nitrofuran metabolites in aquatic productsColloidal gold immunochromatographic method2023-01-18 发布2023-02-18 实施浙江省农产品质量安全学会发 布T/ZNZ 16020231前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的
2、结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会归口管理。本文件起草单位：浙江省水产技术推广总站。本文件主要起草人：柯庆青、王鼎南、李诗言、周钦、何辉、王扬、沈清、孔俏丹、丁雪燕、吴洪喜。T/ZNZ 16020232水产品中四种硝基呋喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法1范围本文件规定了水产品中四种硝基呋喃类代谢物的胶体金免疫层析快速检测方法。本文件适用鱼、虾、蟹、鳖、贝、蛙等水产品中肌肉组织中 3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ，呋喃唑酮代谢物）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ，呋喃它酮代谢物）
3、、氨基脲（SEM，呋喃西林代谢物）、1-氨基-2-乙内酰（AHD，呋喃妥因代谢物）的快速测定。2规范性引用文件下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 20752 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法GB/T 30891 水产品抽样规范3术语及定义本文件没有需要界定的术语和定义4原理样品中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合
4、，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（T 线）上硝基呋喃类代谢物-BSA 偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C 线）颜色深浅比较，对样品中硝基呋喃类代谢物进行定性判定。5试剂和材料除特殊注明外，本文件所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的二级水。5.1 试剂5.1.1 乙酸乙酯（C4H8O2）。5.1.2 正己烷（C6H14）。5.1.3 无水硫酸钠（Na2SO4）：650灼烧 4 h，冷却后贮于密闭干燥容器中备用。5.1.42-硝基苯甲醛（C7H5NO3）。5.1.5 二甲亚砜(CH3)2SO。5.1.6 无水磷酸氢二钾（K2HPO4）。5.1.
5、7 盐酸（HCl）。5.1.8 氯化钠（NaCl）。5.1.9 二水合磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）。5.1.10 十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）。T/ZNZ 160202335.1.11 表面活性剂 S17 C18H35O(CH2CH2O)n-H。5.2 溶剂配制5.2.1 盐酸溶液：量取盐酸（5.1.7）18 mL，用水定容至 1000 mL，混匀，配置成 0.2 mol/L 盐酸溶液。5.2.2 衍生化试剂：取 2-硝基苯甲醛（5.1.4）160 mg，用二甲亚砜溶解并稀释至 10 mL，混匀，现配现用。5.2.3 磷酸氢二钾溶液：取无水磷酸氢二钾（5.1.6）17
6、4.2 g，用水溶解并定容至 1000 mL，混匀，配置成 1 mol/L 磷酸氢二钾溶液。5.2.4 复溶液：磷酸盐缓冲液（10 mmol/L），称取 8.0 g 氯化钠（5.1.8）、2.77 g 十二水合磷酸氢二钠（5.1.10）、0.352 g 二水合磷酸二氢钠（5.1.9），10 g 表面活性剂 S17（5.1.11），用水溶解并定容至 1L，过滤，经 121 灭菌 15 min。5.3 参考物质硝基呋喃代谢物药物标准物质，中文名称、英文名称、CAS 登记号、化学分子式、相对分子量见表 1，各组分纯度99%。表 1 硝基呋喃类代谢物标准物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式
7、、相对分子量中文名称英文名称CAS 登录号化学分子式相对分子量3-氨基-2-恶唑烷酮3-anmino-2-oxazolidinone,AOZ80-65-9C3H6N2O2102.095-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ43056-63-9C8H15N3O3201.221-氨基-2-乙内酰脲盐酸盐1-Aminohydantoinhydrochloride,AHD2827-56-7C3H5N3O2 HCl151.55氨基脲盐酸盐semicarbazid hydrochloride,SEM563-41-7
8、NH2CONHNH2 HCl111.535.4 标准溶液的配制5.4.1 标准储备液（100 mg/L）：分别准确称取适量硝基呋喃代谢物标准物质（5.3）10 mg（精确至 0.0001g），用乙腈溶解并定容至 100 mL 容量瓶中，配制成 100 mg/L 的标准储备液，-18 冷冻避光保存，有效期 12 个月。5.4.2 混合中间标准溶液（1 mg/L）：准确移取标准储备液（5.4.1）各 1 mL 于 100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为 1 mg/L 的混合中间标准溶液，4 冷藏避光保存，有效期 3 个月。5.4.3 混合标准工作溶液（0.01 mg/L）：准确移取
9、 0.1 mL 混合中间标准溶液（5.4.2）于 10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为 0.01 mg/L 的混合标准工作溶液，4 冷藏避光保存，有效期 1个月。5.5 材料5.5.1 快速检测试纸条（含金标微孔）：呋喃唑酮代谢物检测试纸条、呋喃它酮代谢物检测试纸条、呋喃西林代谢物检测试纸条、呋喃妥因代谢物检测试纸条，密封包装，按产品要求保存，即开即用。6仪器6.1电子天平：感量 0.01 g 和 0.0001 g。6.2均质机：转速不小于 8000 r/min。6.3离心机：转速不小于 4000 r/min。T/ZNZ 160202346.4氮气吹干仪或空气吹干仪：加热温度不
10、小于 60。6.5恒温水浴锅：加热温度不小于 70。6.6旋涡振荡仪：转速 0 r/min3000 r/min。6.7微量移液器：10 L100 L，100 L1000 L。6.8胶体金读数仪（必要时）。7测定步骤7.1抽样按照GB/T 30891 要求进行抽样，参考表A.1填写采样信息记录。7.2试样制备鱼、虾、蟹、鳖、贝等水产品按照 GB/T 3089 附录 B 规定进行制样，将试样分成检样和备样两份，并做标记，每份不少于 50 g。蛙类去头、皮、内脏，取肌肉部分放入高速研磨仪中高速研磨，直至成肉糜的状态（特殊要求除外）。检样立即检测或-18 以下冷冻待测，备样-18 以下冷冻保藏，保存期
11、不超过 3 个月。注：虾、蟹的壳、触角和节肢不得在制样过程中混入试样。7.3水解与衍生化称取试样2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入5 mL 0.2 mol/L盐酸溶液（5.2.1）和0.5 mL衍生化试剂（5.2.2），漩涡混合30 s，置于70 的水浴中孵育15 min。7.4提取与净化取出离心管冷却至室温，加入4 mL 1 mol/L磷酸氢二钾溶液（5.2.3）混合均匀，加入7 mL乙酸乙酯（5.1.1）和5 g无水硫酸钠（5.1.3），振荡提取3 min后4000 r/min离心3 min，取上层液体3 mL于5 mL带盖离心管中，60 下水浴氮气流吹干；向吹干
12、的离心管中分别加入2 mL正己烷（5.1.2）和0.5 mL样品复溶液（5.2.4），旋紧离心管盖，上下颠倒20次后4000 r/min离心3 min（或静置至明显分层），待测。7.5测定取出四种硝基呋喃代谢物免疫胶体金快速检测卡（试纸条）和金标微孔（5.5.1），并恢复至适宜工作温度（20 5）。分别吸取7.4中待测液下层溶液100 L于金标微孔中，反复抽吸至金标完全溶解，静置孵化3 min。吸取100 L混匀液滴于检测卡加样孔中并反应58 min，并在2 min内读取结果。注：不同试剂盒制造商间的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。7.6质控试验每批样品应同时进行空白
13、、阴性和阳性对照质控试验。7.6.1空白试验每批样品需做一组空白对照，以复溶液（5.2.4）代替试样提取液，按7.5进行。7.6.2阴性对照称取同类基质空白试样，按7.3、7.4和7.5步骤进行操作。7.6.3阳性对照T/ZNZ 16020235准确称取同类基质空白试样2.00 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入适量硝基呋喃代谢物混合标准溶液（5.4.3），使试样中四种硝基呋喃代谢物含量分别达到检出限或2倍检出限，按7.3、7.4和7.5步骤进行操作。8结果判断及表述可使用胶体金读数仪对结果进行判读，具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视法对结果进行判读时，判
14、定方法见8.1节和8.2节。8.1比色法8.1.1 无效检测试纸条：如控制线（C 线）不出现红色条带（如图 1-1），说明检测试纸条失效，不能进行检测。8.1.2 阴性样品：待检试样检测线（T 线）出现红色条带，且颜色比控制线（C 线）深或一样深（如图1-2），为阴性（表明不含四种硝基呋喃代谢物或者四种硝基呋喃代谢物分别含量均 0.5 g/kg）。8.1.3 阳性样品：待检试样检测线（T 线）出现红色条带，但颜色比控制线（C 线）浅或检测线（T 线）未出现红色条带（如图 1-3），为阳性（表明四种硝基呋喃代谢物分别含量均0.5 g/kg）。图 1-1图 1-2图 1-3图 1 目视判定示意图（
15、目视比色法）8.2消线法8.2.1 无效检测试纸条：如控制线（C 线）不出现红色条带（如图 2-1），说明检测试纸条失效，不能进行检测。8.2.2 阴性样品：待检试样检测线（T 线）和控制线（C 线）均出现红色条带（如图 2-2），为阴性（表明不含四种硝基呋喃代谢物或者四种硝基呋喃代谢物残留量 0.5 g/kg）。8.2.3 阳性样品：待检试样检测线（T 线）不出现红色条带（如图 2-3），为阳性（表明四种硝基呋喃代谢物残留量0.5 g/kg）。T/ZNZ 16020236图 2-1图 2-2图 2-3图 2 目视判定示意图（消线法）9性能指标9.1检出限：AOZ、AMOZ、SEM、AHD 均
16、为 0.5 g/kg。9.2灵敏度：95%。9.3特异性：95%。9.4假阴性率：5%。9.5假阳性率：5%。9.6相对准确率：95%。9.7试剂盒验证方法按照附录 B 执行。10质控试验要求每批样品应设置不低于 10%比例的平行样，空白和阴性对照样品各 1 个，阳性对照样品 2 个(5 倍检出限和检出限各一个)，进行空白和阴性、阳性对照质控试验。当平行样之间的检测结果一致，且空白和阴性、阳性对照试验的结果准确时，判定该批样品检测数据有效，并参照表 A.2 记录试验结果。11阳性样品确认若初检结果为阳性，需按照步骤 7 和 8 进行重新检测，若重复检测结果仍为阳性，按 GB/T 20752作为
17、参比方法进行确证。根据确证结果，参照表 A.3 填写水产品快速检测阳性样品复检结果汇总单。若有必要时，阴性结果样品也可采用参比方法进行确认。12其他本文件所述试剂、检测试纸条信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本文件时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本文件规定的各项性能指标。本文件参比方法为 GB/T 20752。T/ZNZ 16020237附 录 A（资料性）水产品快速检测记录表格水产品快速检测抽样单、结果报告单、复检结果汇总单等记录表格见表 A.1、A.2 和 A.3。表 A.1 水产品快速检测抽样单抽样时间：年月日编号：样品名称样品
18、编号受检单位抽样地点抽样数量检测项目抽样费用受检单位对所填内容和采/抽样品有效性确认：以上所填内容和采/抽样品真实有效。对所填内容和采/抽样品有效性有异议。负责人（签字）：（公章）年月日采/抽样人员行政主管人员：（签字）联系电话：年月日抽样技术人员：（签字）联系电话：年月日备注注注：1、本工作单由受检单位协助采/抽样人员如实填写。2、受检单位负责人、行政人员和采样技术人员须分别在工作单上签字、盖章。本工作单为抽样组织单位与受检单位样品确认的重要依据。3、本工作单一式三联，第一联留承检机构，第二联留抽样组织单位，第三联留受检单位。4、需要做选择的项目，在选中项目的“”中打“”。T/ZNZ 160
19、20238表 A.2 水产品快速检测结果报告单报告编号：_序号样品编号样品名称受检单位检测项目检测结果检测人检测日期质控结果检测人：校对人：审核人：抽检单位（盖章）年月日T/ZNZ 16020239表 A.3 水产品快速检测阳性样品复检结果汇总单复检机构（盖章）：上报时间：序号样品名称样品原编号被抽样单位复检项目复检结果复检时间初检机构初检时间备注填报人：审核人：批准人：T/ZNZ 160202310附 录 B（规范性）试剂盒验证方法空白和添加检出限浓度的验证样品分别不少于20个，可以选择鱼（可包含低脂鱼和高脂鱼）、虾蟹、鳖、蛙、贝类等至少5种水产品基质。参照试剂盒说明书操作，测定出现的假阴/
20、阳性样品数量，按表B.1计算其灵敏度、假阳性率、假阴性率、特异性和准确率。表B.1 快速检测方法性能指标计算方法样品情况a检测结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2显著性差异(2)2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/1.100特异性（p-，%）p-=N22/N2.100假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.100=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.100=100-特异性相对准确度c，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注注：N 为任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。c为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。_