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1、ICS 65.060.99CCS B 90T/ZNZ浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准T/ZNZ 1612023水产品中五氯酚钠残留的快速检测胶体金免疫层析法Rapid detection of pentachlorophenol sodium residue in aquatic productsColloidal gold immunochromatographic method2023-01-18 发布2023-02-18 实施浙江省农产品质量安全学会发 布T/ZNZ 1612023I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的
2、结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：浙江省水产技术推广总站。本文件主要起草人：李诗言、柯庆青、王鼎南、周钦、王扬、何辉、张宜明、陆炜、吴洪喜、丁雪燕。T/ZNZ 16120231水产品中五氯酚钠残留的快速检测胶体金免疫层析法1范围本文件规定了水产品中五氯酚钠的胶体金免疫层析快速检测方法。本文件适用于鱼、虾、蟹、鳖、蛙、贝等中五氯酚钠残留的快速测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用
3、于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 23200.92-2016 食品安全国家标准 动物源性食品中五氯酚残留量的测定 液相色谱-质谱法GB/T 30891 水产品抽样规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理本方法的测定采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的五氯酚钠经有机试剂两次萃取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，五氯酚钠与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中五氯酚钠进行定性判
4、定。5试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。5.1试剂5.1.1 乙腈（CH3CN）。5.1.2 正己烷（C6H14）。5.1.3 氨水（NH3H2O）：含量为 25%28%。5.1.4 硫酸（H2SO4）：=1.83 g/mL。5.1.5 无水硫酸钠（Na2SO4）：650灼烧 4h，冷却后贮于密闭干燥容器中备用。5.1.6 氯化钠（NaCl）。5.1.7 二水合磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）。T/ZNZ 161202325.1.8 十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）。5.1.9 表面活性剂 S9（-CH2N(-CH2CH
5、2O-)x-CH2CH(CH3)O-yH22）。5.2参考物质五氯酚钠参考物质的中文名称、英文名称、CAS 号、分子式、相对分子质量见表 1，纯度94.5%。表 1 五氯酚钠标准物质中文名称、英文名称、CAS 号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS 号分子式相对分子质量五氯酚钠Pentachlorophenolsodium131-52-2C6Cl5NaO288.325.3试剂配制5.3.1 提取液 A：硫酸（5.1.4）和水按体积比 1：99 混合。5.3.2 乙腈溶液：乙腈（5.1.1）和水按体积比 3：1 混合。5.3.3 萃取液 B：乙腈溶液（5.2.2）和氨水（5.1.3）按体
6、积比 23：2 混合。5.3.4 复溶液 C：磷酸盐缓冲液（10 mmol/L），称取 8.00 g 氯化钠（5.1.6）、2.77 g 十二水合磷酸氢二钠（5.1.8）、0.352 g 二水合磷酸二氢钠（5.1.7），5.00 g 表面活性剂 S9（5.1.9），用水溶解并定容至 1 L，过滤，经 121灭菌 15 min。5.4标准溶液配制5.4.1 五氯酚钠标准储备液（以五氯苯酚计，100 g/mL）：取五氯酚钠（5.2）参比物质适量（相当于五氯苯酚 10 mg），用甲醇溶解并定容至 100 mL 棕色容量瓶中，混匀，将溶液转移至棕色玻璃储存瓶中，-18下避光保存，有效期 12 个月。5
7、.4.2 五氯酚钠标准中间液（以五氯苯酚计，1 g/mL）：准确量取 1 mL 五氯酚钠标准储备液（5.4.1），置于 100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，混匀，将溶液转移至棕色玻璃储存瓶中，4下避光保存，有效期 3 个月。5.4.3 五氯酚钠标准工作液（以五氯苯酚计，100 ng/mL）：准确量取 1 mL 五氯酚钠标准中间液（5.4.2），置于 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，混匀，现配现用。5.5材料5.5.1 固相萃取小柱：EMR-Lipid 小柱（3cc，300 mg），或者使用性能相当固相萃取柱。5.5.2 五氯酚钠胶体金免疫层析试剂盒：一般包含胶体金检测卡/试纸条、金标
8、微孔及配套的试剂，密封包装，按产品要求保存。6仪器和设备6.1电子天平：感量 0.01 g 和 0.0 001 g。6.2均质机：转速8 000 r/min。6.3离心机：转速4 000 r/min。6.4氮气吹干仪或空气吹干仪。6.5旋涡仪：转速 0 r/min3 000 r/min。6.6固相萃取装置。6.7微量移液器：10 L100 L，100 L1000 L。T/ZNZ 161202336.8胶体金读数仪（必要时）。7测定步骤7.1抽样按照GB/T 30891要求进行抽样，参考表A.1填写采样信息记录。7.2试样制备与保存鱼、虾、蟹、鳖、贝等水产品按照GB/T 30891要求进行制样。
9、蛙类去头、皮、内脏，取肌肉部分充分均质混合，直至成肉糜的状态（特殊要求除外）。将试样分成检样和备样两份，并做标记，每份不少于50 g。检样立即测试或-18以下冷冻待测，备样-18以下冷冻保藏，有效期不超过3个月。7.3提取与净化准确称取样品4 g(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入8 mL提取液A（5.3.1），旋涡均匀后再加入5 g无水硫酸钠（5.1.5）和5 mL正己烷（5.1.2），震荡提取5 min后以4 000 r/min离心5 min。转移全部上层正己烷溶液于10 mL带盖离心管中，加入2 mL萃取液B（5.3.3），手摇混匀1 min后以4 000 r/min离心
10、5 min。弃去上层正己烷溶液；准确移取1.5 mL下层溶液于固相萃取小柱（5.5.1）上，使用空气压力保持1 s/滴过滤速度，收集全部滤液；移取400 L滤液于40下氮吹或空气吹干后，加入200 L复溶液C（5.3.4）复溶，待测定。注注：可用洗耳球或其他等效装置产生空气压力。7.4测定取出五氯酚钠免疫胶体金快速检测卡/试纸条和金标微孔，并恢复至适宜工作温度（20 5）。吸取100 L待测液置于金标微孔（5.5.2）中，反复抽吸5到10次，静置孵化3 min。吸取100 L混匀液滴于检测卡（5.5.2）加样孔中反应58 min，并在2 min内判读结果。7.5质控试验每批样品应同时进行空白和
11、阴性、阳性对照试验。7.5.1空白对照每批样品需做一孔空白对照，以复溶液C（5.3.4）代替样品测定液，按7.4步骤进行操作。7.5.2阴性对照称取同类基质空白样品，按7.3和7.4步骤进行操作。7.5.3阳性对照准确称取同类基质空白样品4 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入适量五氯酚钠标准工作液（5.4.3），使样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量达到检出限或2倍检出限，按7.3和7.4步骤进行操作。8结果判定要求T/ZNZ 16120234可使用胶体金读数仪对结果进行判读，具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视法对结果进行判读时，目视判定示意图见图1和图2所
12、示。8.1比色法8.1.1阴性结果检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量低于方法检出限，判定为阴性。8.1.2阳性结果检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量高于方法检出限，判定为阳性。8.1.3无效结果控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。图1 目视判定示意图（比色法）8.2消线法8.2.1阴性结果检测线（T线）和控制线（C线）均显色时，表明样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量低于方法检出限，判定为阴性。8.2.2阳性结果检测
13、线（T 线）完全不显色时，表明样品中五氯酚钠（以五氯苯酚计）含量高于方法检出限，判定为阳性。8.2.3无效结果控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。T/ZNZ 16120235图2 目视判定示意图（消线法）8.3质控试验要求每批样品应设置不低于 10%比例的平行样，空白和阴性对照样品各 1 个，阳性对照样品 2 个(大于检出限和检出限各一个)，进行空白和阴性、阳性对照质控试验。当平行样之间的检测结果一致，且空白和阴性、阳性对照试验的结果准确时，判定该批样品检测数据有效，并参照表 A.2 记录试验结果。9结论本方法检测结果为阳性的样品，须采用 GB 23200.92 作为参比
14、方法进行确证。根据确证结果，参照表 A.3 填写结果报告单。若有必要时，阴性结果样品也可采用参比方法 GB 23200.92 进行确认。10性能指标10.1检出限（以五氯苯酚计）：1.0 g/kg。10.2灵敏度：95%。10.3特异性：95%。10.4假阴性率：5%10.5假阳性率：5%。10.6相对准确率：95%。10.7试剂盒性能验证工作方法按照附录 B 执行。11其他本文件所述试剂、试剂条信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本文件规定的各项性能指标。本文件参比方法为 GB 23200.92-
15、2016。T/ZNZ 16120236AA附 录 A（资料性）水产品快速检测记录表格水产品快速检测抽样单、结果报告单、复检结果汇总单等记录表格见表 A.1、A.2 和 A.3。表 A.1 水产品快速检测抽样单抽样时间：年月日编号：样品名称样品编号受检单位抽样地点抽样数量检测项目抽样费用受检单位对所填内容和采/抽样品有效性确认：以上所填内容和采/抽样品真实有效。对所填内容和采/抽样品有效性有异议。负责人（签字）：（公章）年月日采/抽样人员行政主管人员：（签字）联系电话：年月日抽样技术人员：（签字）联系电话：年月日备注注注：1、本工作单由受检单位协助采/抽样人员如实填写。2、受检单位负责人、行政人
16、员和采样技术人员须分别在工作单上签字、盖章。本工作单为抽样组织单位与受检单位样品确认的重要依据。3、本工作单一式三联，第一联交承检机构，第二联留抽样组织单位，第三联留受检单位。4、需要做选择的项目，在选中项目的“”中打“”。T/ZNZ 16120237表 A.2 水产品快速检测结果报告单报告编号：_序号样品编号样品名称受检单位检测项目检测结果检测人检测日期质控结果检测人：校对人：审核人：抽检单位（盖章）年月日T/ZNZ 16120238表 A.3 水产品快速检测阳性样品复检结果汇总单复检机构（盖章）：上报时间：序号样品名称样品原编号被抽样单位复检项目复检结果复检时间初检机构初检时间备注填报人：
17、审核人：批准人：T/ZNZ 16120239附 录 B（规范性）试剂盒验证方法空白和添加检出限浓度的验证样品分别不少于20个，选择鱼、虾、蟹、龟鳖、蛙、贝类等至少5种水产品基质。参照试剂盒说明书操作，测定出现的假阴/阳性样品数量，按表B.1计算其灵敏度、假阳性率、假阴性率、特异性和准确率。表 B.1 快速检测方法性能指标计算方法样品情况a检测结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2显著性差异(2)2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（
18、df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.100特异性（p-，%）p-=N22/N2.100假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.100=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.100=100-特异性相对准确度c，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注注：N 为任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。c为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。_